目的:研究CVB3 VP1蛋白與宿主蛋白MAT1的相互作用對細(xì)胞功能的影響,并通過檢測細(xì)胞周期素（Cyclin D1、Cyclin E1等）,細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK4、CDK2等）,細(xì)胞周期抑制基因p21以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白Rb的表達(dá)水平,探討VP1將Hela細(xì)胞阻滯于G1/S期的分子機制,為研究CVB3的致病機制奠定基礎(chǔ)。方法:1.采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出VP1-D8（3044-3319bp）和VP1-D4（2459-2926bp,陰性對照）基因,將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒p Bud CE4.1中,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒p Bud CE4.1-VP1-D4和p Bud CE4.1-VP1-D8,雙酶切鑒定并DNA測序驗證。2.運用免疫印跡技術(shù),檢測質(zhì)粒p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8、p Bud CE4.1-VP1-D4以及p Bud CE4.1空質(zhì)粒對Hela細(xì)胞MAT1表達(dá)量的影響。3.利用流式細(xì)胞儀分析以上四種質(zhì)粒對Hela細(xì)胞周期的影響。4.Quantative Real-Time RT-PCR檢測以上四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h后,細(xì)胞... 

【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CDK7和MAT1相互作用的結(jié)構(gòu)域Fig1ThestructureofCDK7andMAT1

AT1 存在相互作用，并將 VP1 基因進(jìn)行缺失突變，采用同樣的方法找出 V白中與 MAT1 相互作用的確切范圍，發(fā)現(xiàn) VP1 的 C 端區(qū)域（VP1-D8–859aa）是其與 MAT1 相互作用的必需區(qū)域（圖 2）。然而，VP1-D8 在宿胞內(nèi)是否具有阻滯細(xì)胞周期的功能還有待于進(jìn)一步的證實，其中的機制又么？這是本論文研究的重點。

圖 3 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白對 G1-S 期轉(zhuǎn)換基因的調(diào)節(jié)Fig 3 The regulation of cell cycle regulatory proteins on genes needed in G1-S transition基于上述研究背景及假設(shè)，本論文通過構(gòu)建質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4（陰性對照）并轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞，觀察 MAT1 蛋白水平、細(xì)胞周期的變化、細(xì)胞周期檢查點基因的表達(dá)情況以及 Rb 的磷酸化/非磷酸化水平，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CVB3損傷HeLa細(xì)胞高爾基體結(jié)構(gòu)的機制研究[J]. 金桂林,莫冰,劉發(fā)娣,徐秋芳,劉昕,應(yīng)穎,趙穎潔,羅軍,黃孝天.  中國人獸共患病學(xué)報. 2012(06)
[2]酵母雙雜交技術(shù)篩選與CVB3 VP1直接作用的細(xì)胞蛋白[J]. 劉發(fā)娣,余克花,羅達(dá)亞,徐秋芳,莫冰,羅軍,劉晶星,黃孝天.  中國人獸共患病學(xué)報. 2009(10)

碩士論文
[1]CVB3 VP1與宿主蛋白MAT1相互作用的研究[D]. 金桂林.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2013
[2]CVB3對Hela細(xì)胞高爾基體及其細(xì)胞周期的影響[D]. 劉發(fā)娣.南昌大學(xué) 2009



本文編號：3489723