目的:在糖基工程酵母中表達(dá)抗流感病毒單克隆抗體CR6261,并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和活性測(cè)定。方法:從GenBank獲得CR6261抗體的全基因序列,構(gòu)建輕重鏈表達(dá)載體pPICZα-CR6261-H-L,電轉(zhuǎn)入糖基工程酵母,利用甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子AOX1表達(dá)CR6261抗體蛋白,通過(guò)SDS-PAGE、Western印跡篩選表達(dá)菌株,用Protein A親和層析、Superdex200凝膠過(guò)濾柱分離純化抗體蛋白,應(yīng)用ELISA方法對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行活性鑒定。結(jié)果:CR6261抗體蛋白分泌在培養(yǎng)上清中,且純化后的蛋白與糖基工程酵母表達(dá)的流感病毒血凝素蛋白HA5、HA7有結(jié)合活性,與商業(yè)化三價(jià)流感病毒裂解疫苗亦有結(jié)合活性。結(jié)論:實(shí)現(xiàn)了抗流感病毒單克隆抗體CR6261在糖基工程酵母中的表達(dá),并初步檢測(cè)了其廣譜活性,可為酵母表達(dá)抗體蛋白藥物制備提供參考,ELISA初步評(píng)價(jià)還顯示了其在診斷上的應(yīng)用前景。 

【文章來(lái)源】：生物技術(shù)通訊. 2020,31(01)

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

陽(yáng)性克隆的篩選

用間接ELISA方法檢測(cè)CR6261抗體的活性，抗原為本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)并純化的血凝素HA5、HA7、HA3以及購(gòu)買(mǎi)的商品化三價(jià)流感病毒裂解苗。將HA5、HA7、HA3、裂解苗分別用抗原包被液進(jìn)行1/10稀釋，各取200μL樣品加入96孔酶聯(lián)板第一排，其他排各加入100μL包被液，排槍吸取第一排100μL液體加到下一行中，倍比稀釋；37℃包被1 h，加入PBST清洗1次，每孔加入5%牛奶封閉液；37℃孵育1 h,PBST清洗5次；每孔各加入純化后的CR6261抗體（用5%牛奶進(jìn)行1/500稀釋，且加入200μL酵母裂解液）；37℃溫育1 h，用PBST洗5次；37℃溫育1 h，用PBST水洗5次；每孔各加入100μL羊抗人IgG-HRP（用5%牛奶進(jìn)行1/5000稀釋，且加入200μL酵母裂解液）；37℃溫育1 h，用PBST洗5次；每孔各加100μL顯色液，顯色5～10 min；每孔加入50μL終止液終止顯色；酶標(biāo)儀讀數(shù)，計(jì)算抗體滴度。2 結(jié)果

1 L BMGY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液上清經(jīng)Protein A純化，洗脫樣品進(jìn)行還原SDS-PAGE分析，如圖4A所示，Protein A純化后的樣品存在大量降解條帶。用Superdex200對(duì)樣品進(jìn)一步純化，并對(duì)洗脫樣品進(jìn)行還原SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4B，色譜圖紫外吸收峰為單一吸收峰，說(shuō)明洗脫樣品分子大小相近，從蛋白條帶位置來(lái)看，CR6261抗體的輕重鏈均有表達(dá)且分子大小與陽(yáng)性IgG輕重鏈大小一致。經(jīng)2步純化后獲得了純度較高的抗體蛋白。2.4 CR6261抗體活性分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]甲型H1N1流感病毒血凝素HA1在糖基工程畢赤酵母中的表達(dá)[J]. 張曉紅,劉波,鞏新,唱韶紅,徐威,吳軍.  生物技術(shù)通訊. 2012(01)
[2]N-糖基工程研究進(jìn)展[J]. 吳軍,劉波.  生物產(chǎn)業(yè)技術(shù). 2009(04)
[3]抗HER2人源化單克隆抗體在畢赤酵母中的表達(dá)及其產(chǎn)物分析[J]. 王凌雪,張惟廣,吳軍.  生物技術(shù)通訊. 2008(06)



本文編號(hào)：3486920