目的:在糖基工程酵母中表達抗流感病毒單克隆抗體CR6261,并對其進行結(jié)構(gòu)分析和活性測定。方法:從GenBank獲得CR6261抗體的全基因序列,構(gòu)建輕重鏈表達載體pPICZα-CR6261-H-L,電轉(zhuǎn)入糖基工程酵母,利用甲醇誘導(dǎo)型啟動子AOX1表達CR6261抗體蛋白,通過SDS-PAGE、Western印跡篩選表達菌株,用Protein A親和層析、Superdex200凝膠過濾柱分離純化抗體蛋白,應(yīng)用ELISA方法對純化后的蛋白進行活性鑒定。結(jié)果:CR6261抗體蛋白分泌在培養(yǎng)上清中,且純化后的蛋白與糖基工程酵母表達的流感病毒血凝素蛋白HA5、HA7有結(jié)合活性,與商業(yè)化三價流感病毒裂解疫苗亦有結(jié)合活性。結(jié)論:實現(xiàn)了抗流感病毒單克隆抗體CR6261在糖基工程酵母中的表達,并初步檢測了其廣譜活性,可為酵母表達抗體蛋白藥物制備提供參考,ELISA初步評價還顯示了其在診斷上的應(yīng)用前景。 

【文章來源】：生物技術(shù)通訊. 2020,31(01)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

陽性克隆的篩選

用間接ELISA方法檢測CR6261抗體的活性，抗原為本實驗室表達并純化的血凝素HA5、HA7、HA3以及購買的商品化三價流感病毒裂解苗。將HA5、HA7、HA3、裂解苗分別用抗原包被液進行1/10稀釋，各取200μL樣品加入96孔酶聯(lián)板第一排，其他排各加入100μL包被液，排槍吸取第一排100μL液體加到下一行中，倍比稀釋；37℃包被1 h，加入PBST清洗1次，每孔加入5%牛奶封閉液；37℃孵育1 h,PBST清洗5次；每孔各加入純化后的CR6261抗體（用5%牛奶進行1/500稀釋，且加入200μL酵母裂解液）；37℃溫育1 h，用PBST洗5次；37℃溫育1 h，用PBST水洗5次；每孔各加入100μL羊抗人IgG-HRP（用5%牛奶進行1/5000稀釋，且加入200μL酵母裂解液）；37℃溫育1 h，用PBST洗5次；每孔各加100μL顯色液，顯色5～10 min；每孔加入50μL終止液終止顯色；酶標儀讀數(shù)，計算抗體滴度。2 結(jié)果

1 L BMGY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液上清經(jīng)Protein A純化，洗脫樣品進行還原SDS-PAGE分析，如圖4A所示，Protein A純化后的樣品存在大量降解條帶。用Superdex200對樣品進一步純化，并對洗脫樣品進行還原SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4B，色譜圖紫外吸收峰為單一吸收峰，說明洗脫樣品分子大小相近，從蛋白條帶位置來看，CR6261抗體的輕重鏈均有表達且分子大小與陽性IgG輕重鏈大小一致。經(jīng)2步純化后獲得了純度較高的抗體蛋白。2.4 CR6261抗體活性分析

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3486920