發(fā)布時(shí)間：2021-10-20 20:15

　　目的對(duì)斑馬魚的pGM-T-jak2a wt進(jìn)行定點(diǎn)突變,完成pGM-T-jak2AV581F全長(zhǎng)載體的構(gòu)建,運(yùn)用T7RNA聚合酶對(duì)含有jak2a基因的ORF區(qū)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,在體外合成5端帶有帽子結(jié)構(gòu)的jak2a mRNA分子,為后續(xù)探討斑馬魚MPD（Myeloproliferative disorders）模型的Jak/Stat信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)jak2a基因GeneBank NM₁31093序列V581F突變位點(diǎn)的上下游序列片段設(shè)計(jì)引物,以pGM-T-jak2wt質(zhì)粒載體為模板進(jìn)行PCR后,用Dpn I酶對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化去除模板,然后轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)菌,通過(guò)藍(lán)白篩選酶切對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行鑒定,小量提取質(zhì)粒,NdeI限制性內(nèi)切酶完成pGM-T-jak2a質(zhì)粒的線性化,運(yùn)用T7RNA聚合酶對(duì)jak2a基因進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄及加帽。最后經(jīng)凝膠電泳對(duì)目的片段進(jìn)行鑒定。結(jié)果完成PGM-T-jak2a V581F的定點(diǎn)突變,成功構(gòu)建PGM-T-jak2a V581F載體,DNA序列分析的結(jié)果與GenBank上的序列（NM₁31093）一... 

【文章來(lái)源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：100 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

克隆載體pGM-T圖譜

斑馬魚Jak2a基因編碼區(qū)酶切位點(diǎn)圖譜(通過(guò)NEB獲得）

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文giI197097629|reflNM_001132128. GAAATCCTCCTTTCATCAAACTTAGTGATCCTGGCArTAGTATTACAGTT 2302gi|3B8454211|re￡|NM_001265901. SAAATCCTCCTTTCATCAAACTTAGTGATCCTCJGCATTAGTATTACAGTT 2619gi12285795IdtojIAB006011.il gaaatcctcccttcatcaaacttagtqatcctcxkzatcagtattacagtt 2434gi1139286951ref|NM_031514.1i oeAATCCACCTTTCATCAAACTTAGTGATCCTGGGATTAGCATCACAGTT 2274gi I 37590525 I 典 IBC0S9834.11 GGAACCCACCTTTCATCAAACTTAGTGATCCTGGCATTAGCATTACAGTT 2222gi |71896484Iref INM_00103053e.l SAAACCTTCCTTTTAXAAAACTAAGTGACCCTGGCATCAGTATCACAGTT 2301gi 1188509161 ref | NK_131093.11 GGACACCACCCTTCATCAASCTGAGCG3VCCCGGGCATCAGCATCACCSTC 2199圖lA斑馬魚Jak2aDNA序列與人、小鼠、大鼠等進(jìn)行序列比對(duì)*


本文編號(hào)：3447536