研究背景：心腦血管疾病是全世界主要的致死性疾病,動脈粥樣硬化是其重要的病理基礎(chǔ)。高脂血癥和高膽固醇血癥被認(rèn)為是動脈粥樣硬化發(fā)病及發(fā)展的重要因素。載脂蛋白E（ApoE）在膽固醇和脂蛋白的轉(zhuǎn)運和代謝中發(fā)揮重要作用。ApoE基因敲除小鼠的廣泛應(yīng)用,使得動脈粥樣硬化早期病理機(jī)制的研究取得了很大進(jìn)展。但ApoE敲除小鼠與人類在動脈粥樣硬化病理機(jī)制上相去甚遠(yuǎn)。豬因為在解剖學(xué)和生理上和人類似,適合于建立動脈粥樣硬化大動物模型。目的：通過敲除豬的ApoE基因,建立國際上首批ApoE基因敲除豬,培育動脈粥樣硬化的豬模型,能更好地研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理,同時為進(jìn)一步研究動脈粥樣硬化的預(yù)防治療打下基礎(chǔ)。方法：設(shè)計合適的ApoE基因敲除的CRISPR/Cas9靶點,并組裝CRISPR/Cas9打靶質(zhì)粒；通過CRISPR/Cas9質(zhì)粒與表達(dá)G418抗性的tdTomato質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞,經(jīng)過抗性篩選和PCR產(chǎn)物測序的方式鑒定出ApoE基因雙敲的單細(xì)胞克��；以篩選獲得的ApoE基因雙敲的豬胎兒成纖維細(xì)胞單克隆作為體細(xì)胞核移植供體,通過體細(xì)胞核移植（SCNT）技術(shù),構(gòu)建國際上首例ApoE基因雙敲的克隆... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
全文主要縮略語
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 ApoE敲除細(xì)胞的建立
    1. 實驗儀器與材料
        1.1 實驗儀器
        1.2 實驗材料
        1.3 實驗試劑
        1.4 試劑配制
    2 實驗方法與步驟
        2.1 豬原代成纖維細(xì)胞(PFFs)分離
        2.2 CRISPR/Cas9打靶質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3 打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬原代成纖維細(xì)胞
        2.4 ApoE基因打靶細(xì)胞克隆的篩選及鑒定
    3 實驗結(jié)果
    4 分析與討論
第二部分 ApoE基因敲除豬模型的建立和鑒定
    1 實驗儀器與材料
        1.1 實驗儀器
        1.2 實驗材料
        1.3 實驗試劑
        1.4 試劑配制
    2 實驗方法與步驟
        2.1 ApoE基因敲除豬模型的構(gòu)建
        2.2 ApoE基因敲除豬的鑒定
    3 實驗結(jié)果
    4 分析與討論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況及科研工作情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在動物基因組定點修飾中的應(yīng)用[J]. 周金偉,徐綺嬪,姚婧,余樹民,曹隨忠.  遺傳. 2015(10)
[2]利用TALEN技術(shù)在牛胎兒成纖維細(xì)胞中敲除Myostatin基因[J]. 楊翠翠,佟慧麗,馬興紅,杜巍,劉丹,楊宇,嚴(yán)云勤.  遺傳. 2014(07)
[3]條件性剔除鼠在神經(jīng)元發(fā)育過程中的應(yīng)用[J]. 劉長紅,武明花,李桂源.  臨床與病理雜志. 2014(02)
[4]利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰島素受體底物1（Irs1）基因[J]. 馬元武,馬婧,路迎冬,陳煒,張旭,于磊,張連峰.  中國比較醫(yī)學(xué)雜志. 2014(03)
[5]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[6]CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J]. Andrew R.Bassett,Ji-Long Liu.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
[7]鋅指核酸酶技術(shù)在植物基因工程中的應(yīng)用[J]. 宋蕓,喬永剛,李貴全.  中國生物工程雜志. 2013(01)
[8]轉(zhuǎn)基因動物新技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 羅慶苗,苗向陽,張瑞杰.  遺傳. 2011(05)
[9]鋅指蛋白核酸酶的作用原理及其應(yīng)用[J]. 鐘強(qiáng),趙書紅.  遺傳. 2011(02)
[10]轉(zhuǎn)基因動物研究進(jìn)展[J]. 李想,逍遙,張鑫,楊利國.  中國奶牛. 2009(12)

博士論文
[1]應(yīng)用TALENs以及CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建B細(xì)胞缺失免疫缺陷豬模型[D]. 陳鳳嬌.南京醫(yī)科大學(xué) 2015

碩士論文
[1]轉(zhuǎn)基因克隆兔的相關(guān)研究[D]. 宋偉杰.東北林業(yè)大學(xué) 2011
[2]ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠炎癥相關(guān)基因的表達(dá)研究[D]. 戴學(xué)棟.山東師范大學(xué) 2008



本文編號：3445437