目的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定敲除SIRT2基因的HEK293細(xì)胞系,研究其對組蛋白不同位點(diǎn)的修飾情況。方法構(gòu)建lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒,通過慢病毒包裝,感染HEK293細(xì)胞,嘌呤霉素篩選出陽性克隆。對篩選的細(xì)胞株進(jìn)行T7E1驗(yàn)證,來驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的sgRNA的有效性。應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測SIRT2蛋白水平,篩選得到SIRT2穩(wěn)定敲除細(xì)胞系。使用蛋白質(zhì)免疫印跡的方法在蛋白水平驗(yàn)證SIRT2對組蛋白乙�；⒓谆挠绊�。結(jié)果通過測序證明lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒正確,T7E1驗(yàn)證了所構(gòu)建的質(zhì)粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,使基因組堿基發(fā)生突變。蛋白質(zhì)免疫印跡證明SIRT2敲除細(xì)胞系中SIRT2表達(dá)顯著降低。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除SIRT2的HEK293細(xì)胞中,組蛋白H4乙酰化在賴氨酸第16位（H4K16ac）表達(dá)顯著升高,組蛋白H4乙�；谫嚢彼岬�5位（H4K5ac）表達(dá)下降,組蛋白H3二甲基化在賴氨酸第79位（H3K79me2）表達(dá)升高。結(jié)論獲得SIRT2穩(wěn)定敲除細(xì)胞系,便于后續(xù)SIRT2... 

【文章來源】：醫(yī)學(xué)研究雜志. 2020,49(02)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

SIRT2敲除以后H3K79me2的水平升高

SIRT2敲除以后H4K5ac的水平降低

對SIRT2-sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈,與BsmBⅠ酶切線性化的lentiCRISPR v2質(zhì)粒連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)中,通過測序證實(shí)lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。本文構(gòu)建的lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒有SIRT2-sgRNA-4序列的插入,并且序列與所設(shè)計(jì)的一致。2.T7E1法驗(yàn)證SgRNA活性:


本文編號：3441421