發(fā)布時(shí)間：2017-05-03 20:00

  本文關(guān)鍵詞：人胚肺二倍體細(xì)胞衰老程度評(píng)價(jià)生物學(xué)指標(biāo)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：細(xì)胞衰老是隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞增殖能力和生理功能逐漸下降的變化過(guò)程,是個(gè)體衰老的重要基礎(chǔ)。體外培養(yǎng)二倍體細(xì)胞是目前用于疫苗生產(chǎn)最安全的細(xì)胞基質(zhì),其使用代次限制在生命周期的三分之二以內(nèi)。目前對(duì)不同代次二倍體細(xì)胞在細(xì)胞、蛋白及分子等不同層次的變化尚不清楚,缺乏評(píng)價(jià)二倍體細(xì)胞衰老程度的有效手段。研究二倍體細(xì)胞衰老特征變化,對(duì)生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)安全評(píng)價(jià)以及衰老相關(guān)疾病研究具有重要意義。目的：以人胚肺二倍體細(xì)胞Walvax-2細(xì)胞為研究對(duì)象,在細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、酶學(xué)變化、蛋白表達(dá)以及細(xì)胞生長(zhǎng)等不同水平,通過(guò)檢測(cè)不同代次人胚肺二倍體細(xì)胞衰老相關(guān)標(biāo)記物,篩選出能夠評(píng)價(jià)人胚肺二倍體細(xì)胞衰老程度的可靠生物學(xué)指標(biāo)。方法：1.將Walvax-2細(xì)胞分20代、25代、30代、35代至45代、50代和55代共16個(gè)代次,其中35代到45代之間均隔1代；2倒置顯微鏡下觀察不同代次Walvax-2細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)情況；3.透射電鏡下觀察不同代次Walvax-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；4.以細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)不同代次Walvax-2細(xì)胞β-半乳糖苷酶表達(dá)；5.以TRAP-PCR方法檢測(cè)不同代次Walvax-2細(xì)胞端粒酶活性；6.繪制作生長(zhǎng)曲線,觀察不同代次Walvax-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力；7.通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同代次Walvax-2細(xì)胞周期時(shí)相和細(xì)胞凋亡；8.Western印跡法檢測(cè)不同代次Walvax-2細(xì)胞的P16基因和BMI-1基因的蛋白表達(dá)。結(jié)果：1.倒置顯微鏡下：P20到P45生長(zhǎng)狀態(tài)良好且生長(zhǎng)迅速,細(xì)胞為典型長(zhǎng)梭狀,為致密單層,緊密排列,呈編織狀走行。胞內(nèi)顆粒少,無(wú)空泡,膜清晰,符合二倍體成纖維細(xì)胞特性。P50細(xì)胞排列不規(guī)則,形狀偏扁,體積縮小、顏色加深,邊界不清,形態(tài)不規(guī)則,鏡下可見(jiàn)少許圓縮細(xì)胞。P55貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞散亂,細(xì)胞間空隙多,距離遠(yuǎn),細(xì)胞間的接觸消失,細(xì)胞圓縮數(shù)大量增加, 細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清楚,成批的細(xì)胞出現(xiàn)脫落,離壁飄起的現(xiàn)象。細(xì)胞可傳58代,隨細(xì)胞代次的增加,可見(jiàn)顏色逐漸加深,色素積累。2.透射電子顯微鏡觀察到：P20到P43細(xì)胞體積均正常且骨架結(jié)構(gòu)明顯,細(xì)胞膜微絨毛均勻分布,核糖體豐富,細(xì)胞核完整,核膜光滑,具有較高的核質(zhì)比。P44開(kāi)始出現(xiàn)衰老現(xiàn)象,凋亡小體出現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔膨脹擴(kuò)大,核糖體數(shù)量減少,細(xì)胞質(zhì)色素積聚加深,有空泡形成,細(xì)胞中出現(xiàn)自噬體,細(xì)胞核形狀不規(guī)則,核膜不同程度內(nèi)折,核仁變小,內(nèi)容物增多。P50和P55細(xì)胞衰老更加明顯,大量細(xì)胞變形,體積增大,細(xì)胞膜完整性遭到破壞,細(xì)胞質(zhì)色素積聚加深,微絲和微管崩解,可見(jiàn)大量空泡形成,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體崩解；自噬體數(shù)量增加,細(xì)胞核模糊不清。3.β-半乳糖苷酶檢測(cè)顯示：與初始代次年輕細(xì)胞P20(陽(yáng)性細(xì)胞率13.42%)相比,衰老代次P55的陽(yáng)性細(xì)胞率(37.72%)增強(qiáng),Walvax-2人胚肺二倍體細(xì)胞趨向老化過(guò)程中β-半乳糖苷酶的陽(yáng)性染色率逐代遞增。β-半乳糖苷酶的陽(yáng)性染色率和細(xì)胞代齡之間呈顯著相關(guān)(P0.05)。4.端粒酶的檢測(cè)結(jié)果分析顯示：P20至P55端粒酶活性呈整體減少趨勢(shì),Walvax-2細(xì)胞端粒酶活性與代齡無(wú)顯著性相關(guān)(P0.05)。5生長(zhǎng)曲線分析顯示：P50相比P20的生長(zhǎng)速度明顯減慢,P20的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于P40(P0.05)和P50(P0.05),P30的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于P40(P0.05)和P50(P0.05),P40的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于P50(P0.05)。6流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：不同代次G0/G1期百分比無(wú)變化,G2/M期同S期百分比隨細(xì)胞代齡增長(zhǎng)而降低,P55的S期細(xì)胞基本消失。檢測(cè)到的細(xì)胞碎片隨細(xì)胞代齡增長(zhǎng)而增加,P55的細(xì)胞碎片達(dá)到36.83%。S期所占百分比與細(xì)胞代齡間的增長(zhǎng)顯著負(fù)相關(guān)(P0.05),G2/M期所占百分比與細(xì)胞代齡間的增長(zhǎng)顯著負(fù)相關(guān)(P0.05),細(xì)胞碎片所占百分比與細(xì)胞代齡間的增長(zhǎng)顯著正相關(guān)(P0.05)。7. Western印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：不同代次Walvax-2細(xì)胞的p16蛋白和BMI-1蛋白均未檢測(cè)到表達(dá)。結(jié)論：1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期中的S期、G2/M期和細(xì)胞碎片,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均與Walvax-2細(xì)胞代齡增長(zhǎng)顯著相關(guān)�？蛇x擇作為Walvax-2細(xì)胞衰老程度評(píng)價(jià)的生物學(xué)指標(biāo)。2、端粒酶活性與Walvax-2細(xì)胞代齡間的增長(zhǎng)整體呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。是否適合作為Walvax-2細(xì)胞衰老評(píng)價(jià)生物學(xué)指標(biāo)有待進(jìn)一步研究。3、Walvax-2細(xì)胞中p16蛋白和BMI-1蛋白均未檢測(cè)到表達(dá),不適合作為Walvax-2細(xì)胞衰老評(píng)價(jià)生物學(xué)指標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞衰老 代齡 細(xì)胞形態(tài) β-半乳糖苷酶 端粒酶 細(xì)胞周期 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 衰老評(píng)價(jià)
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 專業(yè)縮略詞英漢對(duì)照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-29
• 1、主要實(shí)驗(yàn)儀器16-17
• 2、主要實(shí)驗(yàn)試劑17-21
• 3、實(shí)驗(yàn)對(duì)象21
• 4、方法21-29
• 4.1 細(xì)胞分組21-22
• 4.2 細(xì)胞基本形態(tài)觀察22
• 4.3 β-半乳糖苷酶檢測(cè)22
• 4.4 端粒酶活性檢測(cè)22-24
• 4.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制24-25
• 4.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)25
• 4.7 P16基因和BMI-1基因表達(dá)的Western印跡法檢測(cè)25-28
• 4.8 統(tǒng)計(jì)方法28-29
• 結(jié)果29-44
• 討論44-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 綜述 細(xì)胞衰老程度的生物學(xué)指標(biāo)研究進(jìn)展60-68
• 綜述參考文獻(xiàn)65-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文68-69
• 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 陳嘉雯;王佳鳳;徐俊峰;周欣;曲成;陳維金;;國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞效果的比較[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2014年05期

2 張聚;劉斯奇;徐寧志;;細(xì)胞老化的基本特征和研究進(jìn)展[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2013年01期

  本文關(guān)鍵詞：人胚肺二倍體細(xì)胞衰老程度評(píng)價(jià)生物學(xué)指標(biāo)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：343617