發(fā)布時間：2021-10-02 00:52

　　目的構(gòu)建NOC2L基因重組慢病毒并使其在293T細胞中表達。方法通過設(shè)計引物及PCR擴增獲得NOC2L全基因片段,將pCDH-GFP載體分別用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切制備線性化載體;NOC2L全基因片段和線性化載體經(jīng)切膠回收后,通過同源重組反應(yīng)將NOC2L全基因片段連接到線性化的pCDH-GFP載體上,構(gòu)建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表達載體;通過菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切、測序等方法對構(gòu)建的NOC2L基因重組慢病毒表達載體進行鑒定,利用構(gòu)建的pCDH-NOC2L-GFP包裝NOC2L慢病毒并使用該慢病毒感染293T細胞。結(jié)果菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切和測序結(jié)果顯示成功將NOC2L基因連接到pCDH-GFP載體上,使用構(gòu)建成功的pCDH-NOC2L-GFP轉(zhuǎn)染293T細胞,能夠成功轉(zhuǎn)染及包裝NOC2L基因重組慢病毒,同時包裝好的NOC2L基因重組慢病毒能夠成功感染293T細胞并過表達293T細胞中的NOC2L基因。結(jié)論采用本研究方法能成功構(gòu)建NOC2L基因重組慢病毒表達載體。 

【文章來源】：右江醫(yī)學(xué). 2019,47(12)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

NOC2L全基因組片段擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳

對pCDH-GFP質(zhì)粒進行雙酶切后,進行1%瓊脂糖凝膠電泳,在約7500 bp處出現(xiàn)條帶,電泳結(jié)果見圖2。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后,獲得30 μL濃度為24.20 ng/μL的線性化載體。2.3 同源重組

將NOC2L基因片段及線性化載體進行同源重組后,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,接種至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。過夜培養(yǎng)后平板上有2個菌落生長,分別挑取單個菌落搖菌后進行菌落PCR驗證,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示只有1個菌落在約2800 bp處出現(xiàn)目的條帶,電泳圖結(jié)果見圖3。取菌落PCR陽性菌液繼續(xù)培養(yǎng)后進行質(zhì)粒小量提取,將提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在2800 bp及7500 bp處分別出現(xiàn)條帶,電泳圖結(jié)果見圖4。送菌落PCR及雙酶切鑒定均為陽性的克隆質(zhì)粒到廣州艾基生物有限公司進行測序,結(jié)果回報顯示,重組的pCDH-NOC2L-GFP中的NOC2L序列與GenBank中登記的NOC2L基因100%同源。圖4 pCDH-NOC2L-GFP質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳

【參考文獻】：
期刊論文
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