目的構(gòu)建NOC2L基因重組慢病毒并使其在293T細(xì)胞中表達(dá)。方法通過設(shè)計(jì)引物及PCR擴(kuò)增獲得NOC2L全基因片段,將pCDH-GFP載體分別用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切制備線性化載體;NOC2L全基因片段和線性化載體經(jīng)切膠回收后,通過同源重組反應(yīng)將NOC2L全基因片段連接到線性化的pCDH-GFP載體上,構(gòu)建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表達(dá)載體;通過菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切、測(cè)序等方法對(duì)構(gòu)建的NOC2L基因重組慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行鑒定,利用構(gòu)建的pCDH-NOC2L-GFP包裝NOC2L慢病毒并使用該慢病毒感染293T細(xì)胞。結(jié)果菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序結(jié)果顯示成功將NOC2L基因連接到pCDH-GFP載體上,使用構(gòu)建成功的pCDH-NOC2L-GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,能夠成功轉(zhuǎn)染及包裝NOC2L基因重組慢病毒,同時(shí)包裝好的NOC2L基因重組慢病毒能夠成功感染293T細(xì)胞并過表達(dá)293T細(xì)胞中的NOC2L基因。結(jié)論采用本研究方法能成功構(gòu)建NOC2L基因重組慢病毒表達(dá)載體。 

【文章來源】：右江醫(yī)學(xué). 2019,47(12)

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

NOC2L全基因組片段擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳

對(duì)pCDH-GFP質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后,進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,在約7500 bp處出現(xiàn)條帶,電泳結(jié)果見圖2。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后,獲得30 μL濃度為24.20 ng/μL的線性化載體。2.3 同源重組

將NOC2L基因片段及線性化載體進(jìn)行同源重組后,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,接種至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。過夜培養(yǎng)后平板上有2個(gè)菌落生長(zhǎng),分別挑取單個(gè)菌落搖菌后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示只有1個(gè)菌落在約2800 bp處出現(xiàn)目的條帶,電泳圖結(jié)果見圖3。取菌落PCR陽(yáng)性菌液繼續(xù)培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒小量提取,將提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在2800 bp及7500 bp處分別出現(xiàn)條帶,電泳圖結(jié)果見圖4。送菌落PCR及雙酶切鑒定均為陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒到廣州艾基生物有限公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果回報(bào)顯示,重組的pCDH-NOC2L-GFP中的NOC2L序列與GenBank中登記的NOC2L基因100%同源。圖4 pCDH-NOC2L-GFP質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 吳軍,王亞洲,楊圣偉,李志裕.  藥學(xué)進(jìn)展. 2019(02)
[2]靶向MDM2-p53相互作用的抗癌治療研究進(jìn)展[J]. 王樾,吳文涌,吳正升.  安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(07)
[3]大鼠Tmub1基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建[J]. 趙曉彪,李光耀,劉孟剛,范霞,陳平.  重慶醫(yī)學(xué). 2016(13)
[4]p63與增殖性皮膚病相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 申藝?yán)?陳強(qiáng),李亞.  河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2015(02)
[5]利用慢病毒載體快速建立表達(dá)外源基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系[J]. 陳平,胡濤,薛敬禮,杜春燕,章金濤,朱奎成,金樹興,王純耀.  生物技術(shù)通報(bào). 2011(07)



本文編號(hào)：3417677