本文關(guān)鍵詞：假結(jié)核耶爾森氏菌精氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)的耐酸機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：精氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)(arginine-dependent acid resistance system,AR3)是存在于多種腸道致病菌中的重要的抗酸系統(tǒng),主要由精氨酸脫羧酶AdiA和逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AdiC組成。AdiA在對(duì)精氨酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)的同時(shí)消耗細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的H+生成胍基丁胺(agmatine),然后通過外膜上的AdiC運(yùn)出胞外并交換新的底物精氨酸進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行下一輪反應(yīng),如此循環(huán)反應(yīng)來保持細(xì)胞內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)從而使細(xì)胞在酸性環(huán)境中存活下來。假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,YP)是耶爾森氏菌屬三大致病菌之一,屬于比較常見的腸道致病菌,因此該菌必須能夠耐受胃里的強(qiáng)酸環(huán)境才可以成功的侵入宿主致病。假結(jié)核耶爾森氏菌對(duì)人體宿主感染后會(huì)引起腸系淋巴結(jié)炎和慢性腹瀉等疾病,有時(shí)也會(huì)引發(fā)敗血癥。本研究以假結(jié)核耶爾森氏菌III型(YPIII)為研究對(duì)象(其全基因組測(cè)序已經(jīng)完成),對(duì)其耐強(qiáng)酸機(jī)制進(jìn)行了探索,為其感染和傳播的控制提供了理論基礎(chǔ)。本論文主要包括以下幾個(gè)方面:1.通過對(duì)YPIII野生型,突變體ΔrovM以及互補(bǔ)株ΔrovM-com在pH3.5酸性條件下的存活率進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)ΔrovM在加精氨酸的酸性條件下存活率明顯要高于野生型,確定了LysR家族調(diào)控蛋白R(shí)ovM與YPIII的抗酸有關(guān)。2.通過對(duì)YPIII野生型,突變體ΔadiA以及互補(bǔ)株ΔadiA-com在pH3.5酸性條件下的存活率進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)野生型與互補(bǔ)株的存活率在外加精氨酸的酸性環(huán)境中明顯的提高,而ΔadiA的存活率則沒有明顯的變化;然后通過比色法測(cè)定AdiA酶活,發(fā)現(xiàn)加入溴甲酚藍(lán)反應(yīng)液后野生型的AdiA活性要高于ΔadiA,證明了AR3系統(tǒng)是通過轉(zhuǎn)運(yùn)H+來保持細(xì)胞內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)。3.在YPIII野生型,突變體ΔrovM以及互補(bǔ)株ΔrovM-com中,通過比色法測(cè)定比較AdiA酶活發(fā)現(xiàn)ΔrovM中的AdiA活性要高于野生型;通過構(gòu)建lacZ報(bào)告基因融合菌株和qRT-PCR反應(yīng),發(fā)現(xiàn)ΔrovM突變體中AR3系統(tǒng)的表達(dá)量遠(yuǎn)高于野生型。證明RovM對(duì)AR3系統(tǒng)有負(fù)調(diào)控作用。4.通過對(duì)重組蛋白His6-RovM和AR3系統(tǒng)啟動(dòng)子進(jìn)行體外EMSA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)RovM蛋白是通過直接結(jié)合該啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控的;通過在YPIII野生型和rovM突變體中對(duì)AR3系統(tǒng)啟動(dòng)子進(jìn)行截短比較分析,發(fā)現(xiàn)RovM在該啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)位于AR3系統(tǒng)上游-300bp左右的區(qū)域;通過DNase I footprint檢測(cè)最終確定了RovM在AR3系統(tǒng)啟動(dòng)子上的特異性結(jié)合位點(diǎn)位于AR3啟動(dòng)子上游的-236bp至-309bp區(qū)域。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)假結(jié)核耶爾森氏菌在強(qiáng)酸性條件下是通過AR3系統(tǒng)將胞內(nèi)H+泵出胞外來保證細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)從而應(yīng)對(duì)酸性脅迫,且該系統(tǒng)的表達(dá)受到LysR家族調(diào)控蛋白R(shí)ovM的阻遏抑制。
【關(guān)鍵詞】：假結(jié)核耶爾森氏菌 精氨酸依賴型抗酸系統(tǒng) 耐酸 RovM蛋白
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1.1 腸道致病菌的感染以及耐酸研究意義12
• 1.2 腸道致病菌的耐酸機(jī)理研究進(jìn)展12-20
• 1.2.1 大腸桿菌的耐酸機(jī)理12-19
• 1.2.1.1 大腸桿菌的耐酸系統(tǒng)12-15
• 1.2.1.2 大腸桿菌中的耐酸系統(tǒng)的調(diào)控15-19
• 1.2.2 其他腸道致病菌的耐酸機(jī)理研究19-20
• 1.3 假結(jié)核耶爾森氏菌耐酸研究現(xiàn)狀20-23
• 1.3.1 假結(jié)核耶爾森氏菌簡介20
• 1.3.2 假結(jié)核耶爾森氏菌致病性研究20-21
• 1.3.3 假結(jié)核耶爾森氏菌的耐酸研究21-23
• 1.4 本研究的意義和主要研究內(nèi)容23-24
• 第二章 材料與方法24-37
• 2.1 材料24-27
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒24-25
• 2.1.2 分子生物學(xué)試劑25-26
• 2.1.3 引物序列26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-37
• 2.2.1 rovM和adiA缺失突變體構(gòu)建27-31
• 2.2.1.1 rovM和adiA上下游同源臂片段擴(kuò)增27-28
• 2.2.1.2 目的片段與載體的雙酶切反應(yīng)28
• 2.2.1.3 連接反應(yīng)28-29
• 2.2.1.4 E. coli感受態(tài)制備29
• 2.2.1.5 轉(zhuǎn)化29
• 2.2.1.6 菌落PCR及雙酶切反應(yīng)驗(yàn)證29-31
• 2.2.1.7 同源重組構(gòu)建rovM和adiA缺失突變體31
• 2.2.2 rovM和adiA回復(fù)突變株構(gòu)建31-33
• 2.2.2.1 pKT100- rovM和pKT100- adiA克隆構(gòu)建31-32
• 2.2.2.2 YPIII感受態(tài)的制備32
• 2.2.2.3 轉(zhuǎn)化32-33
• 2.2.3 RovM蛋白原核表達(dá)純化33-34
• 2.2.3.1 pET15b-rovM克隆構(gòu)建33
• 2.2.3.2 RovM蛋白表達(dá)純化33-34
• 2.2.4 報(bào)告基因融合及 β-gal酶活測(cè)定34-35
• 2.2.4.1 報(bào)告基因lacZ融合菌株構(gòu)建34
• 2.2.4.2 β-gal酶活測(cè)定34-35
• 2.2.5 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)35
• 2.2.6 DNase I footprint檢測(cè)35
• 2.2.7 精氨酸脫羧酶活性定性分析35-36
• 2.2.8 耐酸存活率測(cè)定36
• 2.2.9 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）測(cè)定36-37
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-47
• 3.1RovM參與假結(jié)核耶爾森氏菌YPIII的耐酸過程37-38
• 3.1.1 突變株 ΔrovM構(gòu)建及驗(yàn)證37
• 3.1.2 RovM對(duì)假結(jié)核耶爾森氏菌YPIII耐酸的影響37-38
• 3.2 驗(yàn)證AR3系統(tǒng)參與假結(jié)核耶爾森氏菌YPIII耐酸過程38-40
• 3.2.1 突變株 ΔadiA及回復(fù)菌株 ΔadiA-com構(gòu)建及驗(yàn)證38-39
• 3.2.2 通過存活率測(cè)定驗(yàn)證AR3系統(tǒng)對(duì)假結(jié)核耶爾森氏菌YPIII抗酸的影響39
• 3.2.3 精氨酸脫羧酶(AdiA)活性測(cè)定39-40
• 3.3 RovM對(duì)假結(jié)核耶爾森氏菌YPIII中AR3系統(tǒng)的調(diào)控40-42
• 3.3.1 RovM對(duì)精氨酸脫羧酶(AdiA)活性的調(diào)控40-41
• 3.3.2 融合啟動(dòng)子酶活分析RovM對(duì)AR3系統(tǒng)表達(dá)水平的影響41-42
• 3.3.3 qRT-PCR分析RovM對(duì)AR3系統(tǒng)表達(dá)水平的影響42
• 3.4 RovM對(duì)假結(jié)核耶爾森氏菌YPIII中AR3系統(tǒng)調(diào)控機(jī)理42-47
• 3.4.1 RovM直接結(jié)合于AR3系統(tǒng)啟動(dòng)子adip42-44
• 3.4.2 RovM蛋白在AR3系統(tǒng)的啟動(dòng)子adip上的結(jié)合位點(diǎn)分析44-47
• 3.4.2.1 adip啟動(dòng)子截短分析44-45
• 3.4.2.2 DNase I足跡法檢測(cè)分析45-46
• 3.4.2.3 adip啟動(dòng)子分析46-47
• 第四章 分析與討論47-49
• 第五章 總結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-57
• 致謝57-58
• 作者簡介58

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 羅丹;李志尚;羅虹;周穎川;;抗酸-免疫組化雙重染色法在結(jié)核病研究中的應(yīng)用[J];廣西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1991年02期

2 趙丹;張興樹;;探索抗酸染色液的質(zhì)量控制[J];臨床肺科雜志;2009年07期

3 黃智翔;汪莉;鮮巧陽;郭銘;王欣;唐志佼;;抗酸-免疫組化雙重染色在結(jié)核病組織病理學(xué)研究中的應(yīng)用[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年02期

4 謝泰章;;WF抗酸嗜銀染色法[J];中國麻風(fēng)雜志;1993年03期

5 汪R，

本文編號(hào)：341031