第一部分風疹病毒E72-296亞單位疫苗的制備和有效性評價研究背景風疹病毒（Rubella virus, RV）是披膜病毒科風疹病毒屬的唯一成員,為單股正鏈的RNA病毒,通常在一般人群中引起溫和的疾病,但孕婦感染RV能導致流產(chǎn)、死胎或胎兒出生缺陷,即先天風疹綜合征（Congenital rubella syndrome,CRS）。目前使用的RV疫苗均為減毒活疫苗,接種孕婦存在安全隱患,接種AIDS兒童和免疫缺陷人群可導致嚴重的并發(fā)癥。風疹基因工程亞單位疫苗由于其安全性高于減毒活疫苗,可接種孕婦、AIDS兒童和免疫缺陷人群,是目前風疹疫苗的研究熱點。RV的E1蛋白是RV的包膜糖蛋白,分子上包含重要的T細胞、B細胞和抗體中和表位,在動物體內(nèi)能夠引起體液免疫和一定的細胞免疫。E1蛋白上含有四個中和抗體表位,分別是E1（221-239）, E1（234-252）, E1（254-285）和E1（272-285）。其中,E1（221-239）被認為是主要的中和表位,E1（272-285）被認為含有T細胞表位和誘導中和抗體的表位。有多個研究用原核、畢赤酵母和CHO細胞等系統(tǒng)表達了包含這些表位的E1... 

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畢赤酵母菌密碼子利用率圖

了畢赤酵母菌的密媽子利用率情況）對E1蛋白胞外E (E,-446)基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化方案由上海生工完成，優(yōu)化基因的密碼子利用率如圖2,去除了表達率小于10%的密碼子，增加了畢赤酵母菌利用密碼子的頻率，為構(gòu)建表達載體的目的基因建立了優(yōu)化基因模板。Jlf jJL li—s § s f a ti a a Y ^ t § ? y ￥ a a s S s s stM-J—■MWIIll I ? i■丨…Willi I ■■ I gA llllllllll ^ Ml—I iL ^llWIMIWW； L1 r I |>--^ p-*y>l 1<3?o -r?C3 Oct -an ■? 03 oa "O-a?rt-si ■OKJ -oai -sfcca -a -=?3 oa -sja- 1=1 廠 "I I?' ！^“丨 i 1? 丨’‘‘'I? 3 m 發(fā)努至 ：發(fā)—g § g ？ S ？ § S f S ^ S ？ § J ^ S ^ S ？|'1 I ‘ ‘ '| V Vf-, "ifrrHlTV^ r圖1畢赤酵母菌密碼子利用率圖50

GACCTTAT基因測序結(jié)果與目標片段序列進行比對發(fā)現(xiàn)兩者完全吻合，表明PZaA-E72-:!%、pGAPZaA-E72-304、pGAPZaA-E25-304 和 pGAPZaA-E25-395 表達構(gòu)建成功，可以進行蛋白表達。(四）E72-2%重組蛋白在畢赤酵母菌分泌上清中的表達取Zeocin蹄選陽性克隆，接種于1 L改良YPD培養(yǎng)基中，300 r/min搖床，每天取培養(yǎng)液15 ml，4 °C , 10000 r/min離心10 min,將10 m丨上清濃縮后取20|al濃縮樣品進行SDS-PAGE檢測。如圖4所示，￡72-2%重組蛋白隨達時間的延長表達量增加，從6天開始雜蛋白表達量增加。取5天濃縮樣行SDS-PAGE和Western blot檢測，E72-296重組蛋白能與抗RV E1抗體特異，E72-304、E25-304和E25-395重組蛋白未能在上清中表達(圖5)。

【參考文獻】：
期刊論文
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