發(fā)布時(shí)間：2017-04-30 12:01

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌分泌性酸性磷酸酶（SapM）對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞自噬的抑制作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：建立可以穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白-綠色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白輕鏈3(RFP-GFP-LC3)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系,為自噬研究提供材料。研究結(jié)核分枝桿菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞自噬的影響,探究Rab7在結(jié)核桿菌毒力因子SapM誘導(dǎo)的自噬體-溶酶體融合阻斷中的作用。方法：1用分子克隆的方法構(gòu)建含RFP-GFP-LC3基因的慢病毒重組質(zhì)粒載體,將重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,收集病毒液上清后感染RAW264.7細(xì)胞。經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3的RAW264.7細(xì)胞株,分別用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析感染效率。饑餓處理穩(wěn)定感染的細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的RFP-GFP-LC3斑點(diǎn)。2.分別用SapM.渥曼青霉素、饑餓處理GFP-LC3-RAW264.7細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察自噬體的形成,Western blot法檢測(cè)微管相關(guān)性蛋白輕鏈3(LC3)Ⅱ水平；再用SapM處理GFP-LC3-RAW264.7細(xì)胞后加氯喹,Western blot法檢測(cè)LC3Ⅱ水平。3.siRab7轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,用蛋白免疫印記檢測(cè)P62。mCherry-SapM轉(zhuǎn)染RAW264.7后免疫組化分析SapM與Rab7共定位情況,免疫共沉淀分析SapM與Rab7的關(guān)系。用三種SapM的突變體SapM△arcA, SapM△FReD和SapM△CT轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,分析SapM的不同突變體與Rab7的關(guān)系。結(jié)果：1.成功構(gòu)建了慢病毒載體pLV-CMV-RFP-GFP-LC3,經(jīng)感染和嘌呤霉素篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3的RFP-GFP-LC3-RAW264.7細(xì)胞；2.SapM和饑餓均導(dǎo)致GFP-LC3斑點(diǎn)增多和LC3Ⅱ水平增高,在SapM處理的細(xì)胞中加入氯喹并沒(méi)有引起LC3Ⅱ的進(jìn)一步升高。3.siRab7處理后,細(xì)胞P62水平顯著增高；免疫組化顯示SapM與Rab7在胞內(nèi)共定位：免疫共沉淀分析顯示SapM與Rab7可相互沉淀；三種不同突變形式的SapM中,只有SapM△cT不能與Rab7相互作用。結(jié)論：穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3的RAW264.7細(xì)胞株成功建立,為自噬的研究建立了細(xì)胞平臺(tái)。SapM可阻斷自噬體與溶酶體的融合,從而抑制小鼠巨噬細(xì)胞自噬。SapM誘導(dǎo)的自噬體-溶酶體融合阻斷依賴(lài)于SapM與Rab7的相互作用。
【關(guān)鍵詞】：穩(wěn)定表達(dá) RAW264.7細(xì)胞 結(jié)核分枝桿菌分泌性酸性磷酸酶(SapM) 自噬 Rab7 融合
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 引言13-15
• 第一部分 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3的RAW264.7細(xì)胞系15-26
• 1.1 引言15
• 1.2 材料15-17
• 1.3 方法17-20
• 1.4 結(jié)果20-25
• 1.5 討論25-26
• 第二部分 結(jié)核分枝桿菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)抑制小鼠巨噬細(xì)胞自噬26-37
• 2.1 引言26
• 2.2 材料26-27
• 2.3 方法27-29
• 2.4 結(jié)果29-35
• 2.5 討論35-37
• 第三部分 Rab7在SapM誘導(dǎo)的自噬體-溶酶體融合阻斷中的作用37-48
• 3.1 引言37
• 3.2 材料37-38
• 3.3 方法38-39
• 3.4 結(jié)果39-46
• 3.5 討論46-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 后記或致謝53-54
• 作者簡(jiǎn)介及讀研期間主要科研成果54-55

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