發(fā)布時(shí)間：2017-04-30 05:17

  本文關(guān)鍵詞：Martentoxin的表達(dá)體系優(yōu)化及其與BK通道孔區(qū)的交互結(jié)構(gòu)模擬，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大電導(dǎo)鈣激活(large-conductance Ca2+-activated K+channel,BK)鉀通道是廣泛分布于興奮性和非興奮性細(xì)胞中的一種受電壓和鈣離子雙重門控的鉀離子通道,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性、控制細(xì)胞增殖遷移和滲透壓等生理功能。Martentoxin源于我國(guó)獨(dú)有產(chǎn)毒物種東亞鉗蝎(Buthus martensi Karsch,Bm K),是一種由37個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的短鏈多肽毒素。研究表明,Martentoxin對(duì)BK通道的藥理選擇性高于其它各類型的電壓門控鉀通道(Kv)近千倍。迄今為止,BK通道亞型特異性藥物工具仍極度稀缺,闡明Martentoxin與BK通道間的相互作用模式將有助深入剖析BK通道結(jié)構(gòu)與功能及相關(guān)病理學(xué)成因的分子機(jī)制。本論文工作借助分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)模擬方法,1、針對(duì)Martentoxin原核表達(dá),選用了不同的5種表達(dá)載體以及5種感受態(tài)菌株進(jìn)行多重組合優(yōu)選,并針對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)物濃度、親和時(shí)間以及載量等表達(dá)條件進(jìn)行了分類篩選,優(yōu)選出的表達(dá)條件為:以p GEX-4T-3為載體,以Rosetta菌株為宿主菌,誘導(dǎo)溫度為16度,誘導(dǎo)時(shí)間24h,誘導(dǎo)物濃度0.5 m M,每升菌液3小時(shí)與1 ml填料的親和;2、選用適合通道體外表達(dá)的載體p QE30系統(tǒng),以來(lái)源于原核生物變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)鉀通道Kcs A為分子骨架,構(gòu)建了包含BK通道離子透過(guò)孔區(qū)微結(jié)構(gòu)的Kcs A-BK膜蛋白嵌合體,并在M15菌株大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。運(yùn)用Discovery Studio計(jì)算機(jī)模擬,對(duì)BK通道孔區(qū)進(jìn)行了建模優(yōu)化及評(píng)估。本論文研究結(jié)果為探究BK通道藥物作用新靶點(diǎn)以及設(shè)計(jì)相關(guān)通道疾病治療藥物墊鋪了特異探針的保障前提、方法學(xué)的基礎(chǔ)與理論拓展的空間。
【關(guān)鍵詞】：大電導(dǎo)鈣激活鉀通道 Martentoxin KcsA-BK 體外表達(dá)體系優(yōu)選 計(jì)算機(jī)模擬
【學(xué)位授予單位】：上海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363;Q78
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-20
• 1.1 鉀離子通道簡(jiǎn)介12-14
• 1.2 BK通道的研究進(jìn)展14-15
• 1.3 短鏈蝎毒素的研究進(jìn)展15-18
• 1.4 Martentoxin：特異性神經(jīng)型BK通道阻斷劑18-19
• 1.5 本課題的研究意義19-20
• 第二章 Martentoxin表達(dá)及純化體系的優(yōu)化20-49
• 2.1 材料20-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑20-21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備21-22
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)用液配方22-26
• 2.2 方法26-35
• 2.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建26-30
• 2.2.2 Martentoxin的表達(dá)及純化30-34
• 2.2.3 r Martentoxin的藥理學(xué)活性檢測(cè)34-35
• 2.3 結(jié)果35-47
• 2.3.1 載體的構(gòu)建35-37
• 2.3.2 五種載體的比較篩選37-39
• 2.3.3 Martentoxin的表達(dá)條件39-42
• 2.3.4 Martentoxin的親和層析柱分離42-44
• 2.3.5 目的蛋白Martentoxin的分離純化44-45
• 2.3.6 r Martentoxin在LB和M9培養(yǎng)基中的提純并比較45-46
• 2.3.7 Martentoxin藥理活性的檢測(cè)46-47
• 2.4 討論47-49
• 第三章 BK通道孔區(qū)的結(jié)構(gòu)模擬49-63
• 3.1 材料49
• 3.2 方法49-52
• 3.2.1 p QE30-Kcs A-BK表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建49-50
• 3.2.2 Kcs A-BK嵌合體蛋白的表達(dá)及純化50-51
• 3.2.3 表面等離子共振（SPR）51-52
• 3.3 結(jié)果52-60
• 3.3.1 Kcs A-BK的表達(dá)純化52-53
• 3.3.2 Kcs A-BK的藥理結(jié)合活性鑒定53-55
• 3.3.3 BK通道建模的序列一致性分析55-56
• 3.3.4 BK通道孔區(qū)模型的選取56-58
• 3.3.5 BK模型結(jié)構(gòu)評(píng)估及優(yōu)化58-60
• 3.4 討論60-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 作者在攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)成果67-68
• 作者在攻讀碩士學(xué)位期間所參與的項(xiàng)目68-69
• 致謝69

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本文編號(hào)：336332