基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）是包被囊膜的單股正鏈RNA病毒,是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒屬（Alphavirus）中的一員,蚊蟲叮咬是其主要傳播途徑,人被感染后會引起發(fā)熱、頭痛、斑丘疹及全身性關節(jié)炎等癥狀,極少數(shù)患者可能會出現(xiàn)腦膜炎、心肌炎、肝功能損傷及皮膚黏膜出血,給人類生命健康帶來極大威脅。隨著全球氣候變暖,各國交流日加頻繁,此病毒的傳播范圍也在隨之擴大。2008年,我國發(fā)現(xiàn)首例CHIKV的輸入性病例,之后每年都有輸入性病例報道。我國分布有可傳染CHIKV的蚊蟲種類,因此存在大范圍爆發(fā)的可能性。然而,目前對此病毒的研究并不透徹,尚無有效的預防和治療手段,所以前期對于病毒的檢測診斷顯得尤為重要。本文針對CHIKV檢測診斷方法的建立做了以下兩部分工作:（1）CHIKV和寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）雙重熒光定量RT-PCR方法的建立;（2）針對CHIKV結構蛋白E2單克隆抗體的制備與鑒定。（1）CHIKV和ZIKV雙重熒光定量RT-PCR方法的建立由于CHIKV和ZIKV在發(fā)病初期的癥狀十分相似（發(fā)熱,頭痛,全身肌肉痛等）,... 

【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院武漢病毒研究所)湖北省

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 前言
    1.1 基孔肯雅病毒概述
        1.1.1 基孔肯雅病毒分類
        1.1.2 基孔肯雅病毒的流行病學和病原特征
        1.1.3 基孔肯雅病毒粒子形態(tài)結構
        1.1.4 基孔肯雅病毒的基因組結構特點及生命周期
        1.1.5 基孔肯雅病毒的結構蛋白功能
        1.1.6 基孔肯雅病毒非結構蛋白的功能
        1.1.7 基孔肯雅病毒診斷檢測方法
        1.1.8 基孔肯雅病毒疫苗研制及治療策略
        1.1.9 單克隆抗體概述及應用
    1.2 本研究的目的和意義
        1.2.1 基孔肯雅病毒和寨卡病毒雙重熒光定量RT-PCR研究的意義
        1.2.2 基孔肯雅病毒結構蛋白E2單克隆抗體的制備意義
第2章 基孔肯雅病毒和寨卡病毒雙重熒光定量RT-PCR建立
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗儀器
        2.1.2 細胞系、病毒
        2.1.3 化學試劑和試劑盒
    2.2 實驗方法
        2.2.1 基孔肯雅病毒和寨卡病毒病毒RNA提取
        2.2.2 基孔肯雅病毒和寨卡病毒感染細胞總RNA提取
        2.2.3 雙重實時熒光定量RT-PCR引物和探針的設計
        2.2.4 雙重實時熒光定量RT-PCR體系的配制
        2.2.5 雙重實時熒光定量RT-PCR標準曲線建立
        2.2.6 雙重實時熒光定量RT-PCR法靈敏度和特異性檢測
        2.2.7 雙重實時熒光定量RT-PCR法檢測不同株的CHIKV和ZIKV
        2.2.8 雙重實時熒光定量RT-PCR法檢測ZIKV生長曲線
        2.2.9 雙重實時熒光定量RT-PCR法檢測臨床樣本
    2.3 實驗結果
        2.3.1 雙重實時熒光定量RT-PCR標準曲線
        2.3.2 雙重實時熒光定量RT-PCR靈敏度檢測
        2.3.3 雙重實時熒光定量RT-PCR特異性檢測
        2.3.4 雙重實時熒光定量RT-PCR檢測不同毒株的CHIKV和ZIKV
        2.3.5 雙重實時熒光定量RT-PCR檢測臨床樣本
        2.3.6 雙重熒光定量RT-PCR檢測寨卡病毒(ZIKV)生長曲線
    2.4 討論
第3章 基孔肯雅病毒結構蛋白E2單克隆抗體制備及鑒定
    3.1 實驗材料
        3.1.1 儀器及設備
        3.1.2 材料菌株、細胞、病毒、小鼠
        3.1.3 質粒、酶、器材
        3.1.4 試劑盒及相關試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 基孔肯雅病毒結構蛋白E2的表達純化
        3.2.2 基孔肯雅病毒E2蛋白原核表達
        3.2.3 基孔肯雅病毒E2蛋白純化
        3.2.4 單克隆抗體的制備和鑒定
    3.3 實驗結果
        3.3.1 基孔肯雅病毒E2蛋白原核表達質粒構建
        3.3.2 基孔肯雅病毒E2蛋白原核表達純化
        3.3.3 目的蛋白割膠純化
        3.3.4 ELISA篩選方法的建立
        3.3.5 免疫后鼠源多抗效價測定及驗證
        3.3.6 間接ELISA初篩陽性雜交瘤細胞
        3.3.7 陽性雜交瘤細胞系的IFA檢測
        3.3.8 陽性雜交瘤細胞系的Westernblot檢測
        3.3.9 其他性質鑒定
        3.3.10 陽性雜交瘤細胞系的表位鑒定
        3.3.11 陽性雜交瘤細胞系的中和活性檢測
        3.3.12 腹水抗體制備、純化及SDS-PAGE檢測
        3.3.13 腹水純化抗體的IFA檢測
        3.3.14 腹水純化抗體的Westernblot檢測
        3.3.15 腹水純化抗體特異性鑒定
        3.3.16 腹水純化抗體中和活性檢測
        3.3.17 腹水純化抗體效價檢測
    3.4 討論
第4章 總結與展望
    4.1 總結
    4.2 展望
參考文獻
附錄A 常用縮寫
附錄B 常用試劑配方
致謝
作者簡歷



本文編號：3344505