I.肺炎鏈球菌肽聚糖水解酶LytB的結(jié)構(gòu)和功能研究肺炎鏈球菌是人類(lèi)的主要致病菌之一,它能導(dǎo)致重大人類(lèi)疾病并造成每年一百六十多萬(wàn)人的死亡。研究證據(jù)顯示肺炎球菌的內(nèi)切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶LytB對(duì)肺炎鏈球菌的細(xì)胞分裂以及細(xì)菌在鼻咽部定植發(fā)揮重要作用,然而LytB的生化分子機(jī)制到目前為止還不清楚。我們解析了LytB催化結(jié)構(gòu)域（殘基從375位賴(lài)氨酸至658位天冬氨酸）的晶體結(jié)構(gòu)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為L(zhǎng)ytB其衍射分辨率為1.65A。LytBCAT由三個(gè)結(jié)構(gòu)相對(duì)獨(dú)立的模塊SH3b、WW和GH73組成,這三個(gè)模塊組成一個(gè)“T”字型溝槽構(gòu)成了其催化活性中心。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)比較結(jié)合計(jì)算模擬顯示LytB的底物為四糖五肽,其催化關(guān)鍵殘基為Glu564。體外酶活水解實(shí)驗(yàn)表明蛋白LytB更易于水解敲除基因lytB肺炎鏈球菌中的肽聚糖,這暗示了LytB的特異性底物為未成熟肽聚糖。結(jié)合體外長(zhǎng)鏈分散實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)細(xì)胞分裂分析,我們證明了SH3b、WW和GH73三個(gè)模塊對(duì)于蛋白LytB活性都是必需的。進(jìn)一步的功能分析顯示LytB的完整活性對(duì)于肺炎鏈球菌粘附和侵染人的肺上皮細(xì)胞是非常關(guān)鍵的�；诮Y(jié)構(gòu)的序列比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)LytB... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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電子顯微鏡下的肺炎鏈球菌（來(lái)源于microbewiki)

降解掉(VoUmer et al., 2008a)。不同糖鏈之間的交聯(lián)主要是通過(guò)4位D-Ala梭基與另一條鏈的3位A2pm或L-Lys的氨基直接或通過(guò)一段短肽橋連接（圖1.3)。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的肽聚糖糖鏈部分沒(méi)有差別，都由N-乙酷葡糖胺和N-乙酷胞壁酸構(gòu)成，然而其寡肽鏈組成卻不盡相同，其最大差別在于第3位氨基酸在革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）中為2,6-二氨基庚二酸（A2pm)(圖1.3A)，而在革蘭氏陽(yáng)性菌（如肺炎鏈球菌）中是L-賴(lài)氨酸（圖1.3B)。B D-Ala 一 Ala -]乂 \ciU^ I ser、\ cx>M*o?<o*^*OiCiJOH or-??OK*x?*o?x? Q-AiS — 廣 D~Aia^ <■女 U 9? ^ I ^ 冊(cè)O(shè)cfMc-MurMc \ j fytW COOH CO????CO?*^h<OOM COmkCHCQ'NHOICOOH L_LyG L LyS L:LySi'Ata \ in, ^ / ^ H w? 士、、 丨 i I+ \ 5 / ^ ^ ^ D-iGin D-iGin D-tGIn； g L-Aia L-Ala l-Ala|&?^M04MbKOOH 產(chǎn) I I I(^IcNA^j^urNA^j^lcNA^j^urNA^I^IcNA^jj^urNA^圖1.3大腸桿菌A)和肺炎鏈球菌B)的肽聚糖結(jié)構(gòu)（根據(jù)(Vollmer etal., 2008a)修改繪制）。肽聚糖的合成總的來(lái)說(shuō)可以被分為三個(gè)階段：首先，水溶性的UDP活化的前導(dǎo)物（如 UDP-N-acetylglucosamine 和 UDP-N-acetylmuramyl pentapeptide)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成(Barreteau et al., 2008);其次，在細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，新合成的UDP活化的前導(dǎo)物被裝配到細(xì)胞膜十一碳二燒磷酸酯上形成脂錯(cuò)定的二糖五肽結(jié)構(gòu)單元[NAG-NAM-L-Ala-y-D-Glu-meso-Aipm (or L-Lys)-D-Ala-D-Ala] (lipid II)，再在翻轉(zhuǎn)酶的作用下由細(xì)胞質(zhì)一側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外；再次，脂質(zhì)體lipid II通過(guò)釋放十一碳二稀焦憐酸

脂質(zhì)體lipid II通過(guò)釋放十一碳二稀焦憐酸，將新合成的二糖五肽單元插入到新生的肽聚糖糖鏈上（圖1.4)。具體來(lái)說(shuō)，第一階段在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成，首先由MurA將憐酸稀醇丙酮酸的婦醇基轉(zhuǎn)移到UDP-GluNAc上形成稀醇式UDP-GluNAc，然后再NADPH依賴(lài)的MurB酶作用下還原為UDP-MurNAc;生成的UDP-MurNAc在酶MurC、MurD、MurE 的作用下依次分別加上 L-Ala、D-Glu 和 mesodiaminopimelic (meso-A2pm)acid 或 L-Lys 生成 UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu-meso-A2pm acid ( orUDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu-L-Lys)；然后酶 MurF 催化將 D-Ala-D-Ala 偶聯(lián)到MurE 的產(chǎn)物上生成 UDP-MurNAc-L-Ala-Y-D-Glu-meso-A2pm (orL-Lys)-D-Ala-D-Alac第二階段也在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行，由膜蛋白MraY將第一階段的產(chǎn)物UDP-MurNAc-pentapeptide轉(zhuǎn)移到H—■碳二條磷酸酯載體上形成的產(chǎn)物通常稱(chēng)為脂質(zhì)體I (lipid I);緊接著酶MurG將UDP-GlcNAc的糖基轉(zhuǎn)移到lipidI上生成所謂的脂質(zhì)體lipid II。第三階段，脂質(zhì)體lipid II在翻轉(zhuǎn)酶FtsW-RodA復(fù)合物作用下有細(xì)胞質(zhì)一側(cè)跨膜翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞外；翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞外的lipid II再在轉(zhuǎn)糖基酶的作用下通過(guò)聚合反應(yīng)插入到新生肽聚糖鏈上。參與此轉(zhuǎn)糖基過(guò)程的酶由4


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