阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是以學(xué)習(xí)記憶障礙為特征的一種年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。其病理特征為腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑（Senile plaques,SP）、神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles,NFTs）和神經(jīng)元數(shù)量減少等。隨著世界老齡化的日趨嚴重,其發(fā)病率逐步增加。AD已嚴重影響著人類健康,給患者及其家庭帶來巨大的痛苦和經(jīng)濟負擔(dān)。目前,AD的發(fā)病機制依然沒有明確,需要進一步深入探索。本研究則是利用斑馬魚鋁模型篩選出線粒體相關(guān)易感基因UCP2,通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了UCP2基因敲除的斑馬魚模型,再以該模型初步研究UCP2在鋁致癡呆中的作用。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1、建立斑馬魚鋁暴露模型并篩選線粒體相關(guān)易感基因?qū)⒁吧桶唏R魚成魚暴露于酸性氯化鋁（pH 5.8,100μg/L AlCl₃）40天,通過T迷宮測試其行為學(xué)變化,RT-qPCR篩選出與線粒體功能相關(guān)的易感基因。與空白對照組相比,AlCl₃暴露組的斑馬魚進入富集區(qū)的時間延長（P<0.01... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)工作原理圖

處于燒杯中）。具體步驟按照蒲韻竹[34]等實驗方案進行，斑馬魚分組次放置 T 迷宮中自由游動 2 h，使其適應(yīng) T 迷開始測試，將斑馬魚用漁撈小心放入起始區(qū)，利用監(jiān)測系統(tǒng)始點到進入EC區(qū)的時間（潛伏期），每條斑馬魚的測試總時準(zhǔn)：要求每條斑馬魚必須進入 EC 區(qū)且停留時間大于 30 s的斑馬魚，皆在 EC 區(qū)給予食物獎賞；而沒有進入 EC 區(qū)將其引入 EC 區(qū)，且停留 3 min，給予食物獎賞。測試后編號的容器中（單獨培養(yǎng)），測試期間只能在 EC 區(qū)給予每天早上保證同一時間開始測試，記錄其潛伏時間。

-△△Ct法進行計算。2 采用 CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建斑馬魚 UCP2 基因敲除模型實驗2.1 CRISPR/Cas9 基因敲除靶位點設(shè)計通過Esembl網(wǎng)站查詢斑馬魚UCP2的基因組DNA外顯子序列及其功能區(qū)，按照SPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計原理進行UCP2基因敲除靶點的設(shè)計，通過網(wǎng)站The ZiFiTeter（http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx）上尋找一個合適UCP敲除靶點�；虬悬c的設(shè)計原則為：結(jié)構(gòu)須滿足5'-GG-N18-NGG-3'。其中5'端的GG是T7啟的一部分，是為了增加轉(zhuǎn)錄效率，設(shè)計基因敲除靶點時可以不考慮該因素，但3須滿足PAM（即NGG）結(jié)構(gòu)。其次，敲除靶點的選擇必須保證靶點處的堿基序夠發(fā)生改變（插入或者缺失），最好能夠引起移碼突變，這樣就可以引起一系列酸發(fā)生改變，進而影響基因功能的表達。本實驗所設(shè)敲除靶點位于UCP2基因的外顯子上，剛好處于基因的功能區(qū)，并且所選靶點序列上存在特定BsmAI酶切位便于后期的敲除驗證及篩選，如圖5所示。

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3252326