阿爾茨海默�。ˋlzheimer’s disease,AD）是以學(xué)習(xí)記憶障礙為特征的一種年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。其病理特征為腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑（Senile plaques,SP）、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles,NFTs）和神經(jīng)元數(shù)量減少等。隨著世界老齡化的日趨嚴(yán)重,其發(fā)病率逐步增加。AD已嚴(yán)重影響著人類健康,給患者及其家庭帶來(lái)巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前,AD的發(fā)病機(jī)制依然沒(méi)有明確,需要進(jìn)一步深入探索。本研究則是利用斑馬魚(yú)鋁模型篩選出線粒體相關(guān)易感基因UCP2,通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了UCP2基因敲除的斑馬魚(yú)模型,再以該模型初步研究UCP2在鋁致癡呆中的作用。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1、建立斑馬魚(yú)鋁暴露模型并篩選線粒體相關(guān)易感基因?qū)⒁吧桶唏R魚(yú)成魚(yú)暴露于酸性氯化鋁（pH 5.8,100μg/L AlCl₃）40天,通過(guò)T迷宮測(cè)試其行為學(xué)變化,RT-qPCR篩選出與線粒體功能相關(guān)的易感基因。與空白對(duì)照組相比,AlCl₃暴露組的斑馬魚(yú)進(jìn)入富集區(qū)的時(shí)間延長(zhǎng)（P<0.01... 

【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)工作原理圖

處于燒杯中）。具體步驟按照蒲韻竹[34]等實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行，斑馬魚(yú)分組次放置 T 迷宮中自由游動(dòng) 2 h，使其適應(yīng) T 迷開(kāi)始測(cè)試，將斑馬魚(yú)用漁撈小心放入起始區(qū)，利用監(jiān)測(cè)系統(tǒng)始點(diǎn)到進(jìn)入EC區(qū)的時(shí)間（潛伏期），每條斑馬魚(yú)的測(cè)試總時(shí)準(zhǔn)：要求每條斑馬魚(yú)必須進(jìn)入 EC 區(qū)且停留時(shí)間大于 30 s的斑馬魚(yú)，皆在 EC 區(qū)給予食物獎(jiǎng)賞；而沒(méi)有進(jìn)入 EC 區(qū)將其引入 EC 區(qū)，且停留 3 min，給予食物獎(jiǎng)賞。測(cè)試后編號(hào)的容器中（單獨(dú)培養(yǎng)），測(cè)試期間只能在 EC 區(qū)給予每天早上保證同一時(shí)間開(kāi)始測(cè)試，記錄其潛伏時(shí)間。

-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。2 采用 CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建斑馬魚(yú) UCP2 基因敲除模型實(shí)驗(yàn)2.1 CRISPR/Cas9 基因敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)通過(guò)Esembl網(wǎng)站查詢斑馬魚(yú)UCP2的基因組DNA外顯子序列及其功能區(qū)，按照SPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行UCP2基因敲除靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)，通過(guò)網(wǎng)站The ZiFiTeter（http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx）上尋找一個(gè)合適UCP敲除靶點(diǎn)�；虬悬c(diǎn)的設(shè)計(jì)原則為：結(jié)構(gòu)須滿足5'-GG-N18-NGG-3'。其中5'端的GG是T7啟的一部分，是為了增加轉(zhuǎn)錄效率，設(shè)計(jì)基因敲除靶點(diǎn)時(shí)可以不考慮該因素，但3須滿足PAM（即NGG）結(jié)構(gòu)。其次，敲除靶點(diǎn)的選擇必須保證靶點(diǎn)處的堿基序夠發(fā)生改變（插入或者缺失），最好能夠引起移碼突變，這樣就可以引起一系列酸發(fā)生改變，進(jìn)而影響基因功能的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)敲除靶點(diǎn)位于UCP2基因的外顯子上，剛好處于基因的功能區(qū)，并且所選靶點(diǎn)序列上存在特定BsmAI酶切位便于后期的敲除驗(yàn)證及篩選，如圖5所示。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]22種山茶科植物葉片鋁含量及其亞細(xì)胞分布[J]. 渠心靜,陳雪燕,戴生玉,袁軍.  分子植物育種. 2018(03)
[2]紹興地區(qū)食品中鋁監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J]. 馬丹英,邢超,張炎艷,王晶,蔣興祥.  預(yù)防醫(yī)學(xué). 2018(02)
[3]深圳市2015年市售茶葉中金屬污染現(xiàn)況及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]. 楊淋清,王舟,潘柳波,張慧敏,羅賢如,李思果,張錦周,黃薇.  中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué). 2017(12)
[4]CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腦科學(xué)中的應(yīng)用策略[J]. 張騎鵬,孫安陽(yáng).  科學(xué)通報(bào). 2017(31)
[5]最新食品添加劑系列國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)的變化[J]. 郜軒宇,臧英男,許靜.  現(xiàn)代食品. 2017(19)
[6]2013-2016年濟(jì)南市膳食食品中鋁殘留量監(jiān)測(cè)及人群暴露評(píng)估[J]. 焦海濤,張?chǎng)?楊曉倩,孫延斌,曹小麗,劉仲,劉素華.  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2017(16)
[7]Role of Microtubule-associated Protein Tau Phosphorylation in Alzheimer’s Disease[J]. 馬榮紅,張瑤,洪小月,張俊菲,王建枝,劉恭平.  Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2017(03)
[8]Effects of medicinal plants on Alzheimer’s disease and memory deficits[J]. Muhammad Akram,Allah Nawaz.  Neural Regeneration Research. 2017(04)
[9]鋁暴露對(duì)大鼠肝結(jié)構(gòu)和功能的影響[J]. 潘麗娜,李艷飛.  現(xiàn)代畜牧科技. 2017(04)
[10]鋁的危害與防治方法研究[J]. 李彩云.  廣東化工. 2017(06)

博士論文
[1]氟中毒腎損傷時(shí)STC1、UCP2的表達(dá)與作用及高鈣干預(yù)對(duì)其影響的機(jī)制研究[D]. 張永春.重慶醫(yī)科大學(xué) 2012

碩士論文
[1]鋁對(duì)大鼠成骨細(xì)胞礦化過(guò)程的影響[D]. 宋淼.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[2]鋁對(duì)斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其相關(guān)機(jī)制初步研究[D]. 李春杰.西南大學(xué) 2014
[3]解耦聯(lián)蛋白2對(duì)線粒體氧化損傷誘導(dǎo)端粒依賴性衰老的干預(yù)和機(jī)制[D]. 郭鑫.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2013
[4]斑馬魚(yú)阿爾茨海默病動(dòng)物模型的建立[D]. 蒲韻竹.西南大學(xué) 2013
[5]線粒體解耦聯(lián)蛋白2與抑郁癥的相關(guān)性研究[D]. 吳芳芳.南京醫(yī)科大學(xué) 2013
[6]線粒體解耦聯(lián)蛋白2與帕金森病的相關(guān)性[D]. 劉洋.南京醫(yī)科大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3252326