孢子絲菌病是由申克孢子絲菌引起的皮膚、皮下組織及附近淋巴管的慢性感染。近年,孢子絲菌病的發(fā)生率逐年攀升。孢子絲菌在溫度誘導(dǎo)下可進行形態(tài)轉(zhuǎn)換,25°C呈菌絲相生長,37°C則呈酵母相生長。孢子絲菌向酵母相進行形態(tài)轉(zhuǎn)換的過程與該菌的毒力形成關(guān)系密切。目的:明確溫度誘導(dǎo)下孢子絲菌向酵母相轉(zhuǎn)化過程中形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)表達圖譜及DRK1基因表達水平的變化情況。方法:1、將活化的孢子絲菌標準株ATCC10268于25°C SDA液基培養(yǎng)96H后轉(zhuǎn)種于37°C BHI液基中繼續(xù)振顫培養(yǎng)24H、36H、48H,觀察不同時段菌體的光鏡及電鏡下形態(tài)。2、雙向電泳分離菌絲相及早期酵母相孢子絲菌的總蛋白質(zhì),以PD Quest 8.0軟件進行圖像分析,隨機選取30個酵母相上調(diào)表達的蛋白質(zhì)點進行肽指紋圖譜分析,Mascot Peptide Mass Fingerprint數(shù)據(jù)檢索確定其功能。3、RACE PCR擴增酵母相特異表達的蛋白質(zhì)組氨酸激酶DRK1的cDNA全長并進行序列測定,以Bioedit軟件推導(dǎo)氨基酸的序列,并確定其功能區(qū)。結(jié)果:1、申克孢子絲菌于25°C SDA和37°C BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后會呈現(xiàn)出... 

【文章來源】：大連醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換過程中（BHI液基培養(yǎng)36H時）的透射電鏡下所見

認為孢子絲菌感染宿主后向酵母相轉(zhuǎn)化時經(jīng)歷三種轉(zhuǎn)化方式：①菌絲細胞質(zhì)濃縮，由菌絲直接出芽形成分生孢子，孢子的細胞壁與菌絲細胞壁最內(nèi)層相延續(xù)（圖4 b、c）。皮炎瓶霉菌、鼻疽組織胞漿菌也以該方式形成酵母相分生孢子[20]。②由分生孢子出芽形成酵母相孢子。③菌絲頂端形成串狀排列的分裂子細胞，由分裂子細胞進一步形成酵母細胞。以該方式向酵母相轉(zhuǎn)化的還見于巴西副球菌。上述三種轉(zhuǎn)化方式可能被不同的機制調(diào)控[21]。本研究于體外誘導(dǎo)菌絲相孢子絲菌向酵母相的轉(zhuǎn)化過程亦見以上三種轉(zhuǎn)化方式，且于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)36H即可發(fā)生。另外Carbonell[22]還提出雙相真菌的酵母細胞是由菌絲近分隔處的結(jié)構(gòu)擴大膨出而形成，酵母相細胞的細胞壁是由菌絲相細胞壁的內(nèi)層形成的，此種提法與Howard提出的第1種轉(zhuǎn)化方式類似。孢子絲菌酵母相特征性超微結(jié)構(gòu)即是細胞壁外層出現(xiàn)富含微原纖維的電子致密層[21]，該觀點在我們的研究中也得到證實。細胞壁因參與真菌形態(tài)的形成及其與宿主的相互作而在雙相真菌毒力的研究中備受關(guān)注。Toledo[18]發(fā)現(xiàn)申克孢子絲菌菌絲相細胞壁的多糖成分為β-葡糖�；拾贝迹湍赶鄤t為β-葡糖�；拾贝己挺�-半乳糖。皮炎芽生菌菌絲相向酵母相轉(zhuǎn)化時細胞壁的α-（1,3）葡聚糖增多、β-（1,3）葡聚糖減少[23]，且皮炎芽生菌的毒力與α-（1

結(jié) 果1、蛋白圖譜的總體觀察圖5顯示了菌絲相及早期酵母相總蛋白二維電泳的結(jié)果。我們以PDQuest 8.0軟件比較蛋白質(zhì)點染色的強弱，鑒定出300個菌絲相與早期酵母相差異表達的蛋白質(zhì)點。菌絲相與酵母相蛋白圖譜中染色強度相同者被定義為“共有蛋白”(例如Spot Y；圖 4、5)；菌絲相與酵母相蛋白圖譜中染色強度不同者被定義為“差異蛋白” 。其中兩相均見表達但表達水平有差異者被稱為上/下調(diào)蛋白(SpotA ，B and D ；圖 4、5)，而于其中一相有表達者被稱為特異表達的蛋白（Spot C；圖 4、5）。我們隨機選擇了30個酵母相特異或上調(diào)表達的蛋白質(zhì)點進行一級質(zhì)譜分析。由于孢子絲菌的全基因組序列尚未公布，我們便通過在整個真菌范圍內(nèi)進行同源搜索來對被檢測的蛋白質(zhì)進行鑒定及功能分析。（表1）圖 5 孢子絲菌總蛋白的雙向電泳圖。A為25°C SDA液基培養(yǎng)96H的菌絲相蛋白；B為37°C BHI液基培養(yǎng)36 H的早期酵母相蛋白。Y點為共有蛋白，標記有紅色方框的為酵母相特異表達的蛋白，其他箭頭所示為酵母相上調(diào)表達的蛋白。（蛋白點的標識與圖6及表1中的標識相對應(yīng)）。


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