發(fā)布時間：2021-06-16 06:52

　　目的探討腦組織外泌體提取、鑒定及腦室注射活體示蹤方法。方法采用蔗糖梯度離心法,多次離心去除雜質(zhì),最終得到純度較高的腦組織外泌體,采用電鏡及western-blot技術(shù)對不同密度蔗糖溶液內(nèi)的外泌體進(jìn)行鑒定,DiR （1,1’-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine Iodide）染料標(biāo)記后在近紅外二區(qū)儀器下觀察腦室注射外泌體后在體內(nèi)的遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果應(yīng)用蔗糖梯度離心法進(jìn)行超高速離心可得到背景較為干凈的腦組織外泌體,DiR染料可對外泌體進(jìn)行標(biāo)記并顯示外泌體在體內(nèi)轉(zhuǎn)移途徑。結(jié)論應(yīng)用蔗糖梯度離心法可成功提取腦組織中外泌體,DiR染料可對外泌體標(biāo)記并進(jìn)行活體示蹤。 

【文章來源】：卒中與神經(jīng)疾病. 2020,27(01)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

電鏡下觀察各層溶液中外泌體

圖1 電鏡下觀察各層溶液中外泌體在使用蔗糖梯度離心提取組織外泌體之前人們對小鼠、獼猴或人類的組織使用過濾、渦旋震蕩、均質(zhì)化等方法[25-26],但是均存在提取純度過低、背景雜質(zhì)較多等問題;再者,腦組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜,包括各種神經(jīng)細(xì)胞及纖維結(jié)締組織,既往方法未能充分對腦組織中各個成分進(jìn)行解離,從而造成腦組織提取外泌體濃度過低甚至無法得到外泌體。本實驗采用3型膠原酶充分解離組織、三重蔗糖墊、密度梯度離心方法,分離腦組織外泌體,在溶液F1、F2、F3、F4各層中均可見外泌體分布,電鏡下呈典型杯狀囊性結(jié)構(gòu),直徑為50～150 nm,Western-blot檢測各層均有外泌體標(biāo)記蛋白Alix、Hsp70、Flotillin-1表達(dá),證實成功分離腦組織外泌體,相對于傳統(tǒng)方法,本方法可從腦組織中穩(wěn)定提取外泌體,并保證外泌體形態(tài)完整,為進(jìn)一步對腦組織外泌體所攜帶miRNA及蛋白研究奠定堅實的基礎(chǔ)。然而,目前的分離及標(biāo)記方法尚不能分離外泌體或亞群,對于其功能的分析更加困難,本研究描述的方法也未分離出單獨的外泌體群[27]。相比于其他分外泌體分離方法,蔗糖梯度離心法可對樣本進(jìn)行大批量分離,并且不被化學(xué)試劑污染,但是樣本處理耗時較長,設(shè)備相對昂貴,再者超高速離心可能在一定程度上破壞外泌體結(jié)構(gòu),從而影響相應(yīng)的功能。外泌體領(lǐng)域的研究仍需進(jìn)一步深入。細(xì)胞培養(yǎng)并檢測細(xì)胞分泌的外泌體可以作為更好的選擇,但是一種細(xì)胞同樣可分泌多種外泌體,對于外泌體的研究仍然任重而道遠(yuǎn)。

外泌體因其獨特的結(jié)構(gòu)以及穿越血腦屏障的功能在生物標(biāo)記物、藥物載體、神經(jīng)血管重塑及治療方面具有極大的潛能。但是現(xiàn)在依然存在多種問題:外泌體內(nèi)各種生物活性分子間的相互作用機(jī)制未完全闡明;上述提到的RNA的研究多局限于miRNA,其他特異性RNA發(fā)現(xiàn)較少。外泌體對于疾病的診斷及預(yù)后等方面需要進(jìn)一步去研究。


本文編號：3232593