人類甲型血友病是FVⅢ基因突變所產生的罕見遺傳性疾病。甲型血友病小鼠模型可用于該疾病的藥物研發(fā)、預防和治療手段等研究。已有基于ES同源重組制作的基因敲除小鼠模型,但該方法效率低、周期長、成本高。隨著ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術的發(fā)展,尤其是TALEN和CRISPR/Cas9技術具有高效率、易操作、短周期、低費用等優(yōu)勢,成為應用最廣泛的基因編輯技術,使制備基因敲除小鼠模型更為便捷。本課題分別通過TALEN和CRISPR/Cas9技術敲除小鼠的FVⅢ基因,構建甲型血友病小鼠模型。在細胞水平和動物個體上比較了兩種技術的效率,驗證了敲除的FVⅢ基因在后裔中傳遞的規(guī)律,并分析了基因敲除小鼠的表型。以小鼠FVⅢ基因第三外顯子為靶向,構建TALEN核酸酶表達載體。細胞實驗顯示5對TALEN組合（T1-T5）中只有2對（T2、T5）發(fā)生基因編輯,突變率分別為16%和38%。動物實驗顯示將5對TALEN組合的mRNA分別注射至62、145、112、89、119枚胚胎,獲得57、140、92、81、114枚存活胚胎并移植至受體,出生10、39、26、0、28只小鼠。T7EI檢測和測序驗證... 

【文章來源】：南京師范大學江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 基因編輯技術
        1.1.1 基于ES打靶的同源重組技術
        1.1.2 核酸酶介導的基因編輯技術
            1.1.2.1 ZFN技術
            1.1.2.2 TALEN技術
            1.1.2.3 CRISPR/Cas9技術
    1.2 FVⅢ與甲型血友病
        1.2.1 FVⅢ結構與功能
        1.2.2 甲型血友病
            1.2.2.1 甲型血友病的臨床表現(xiàn)
            1.2.2.2 甲型血友病的發(fā)病機制
    1.3 甲型血友病小鼠模型的研究意義
第二章 TALEN技術介導的FVⅢ基因敲除小鼠的制備
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗材料和試劑
        2.1.2 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 載體構建
            2.2.1.1 設計TALEN識別序列
            2.2.1.2 載體構建
        2.2.2 TALEN對培養(yǎng)細胞的基因編輯
            2.2.2.1 細胞轉染
            2.2.2.2 轉染細胞提取基因組
            2.2.2.3 提取細胞基因組進行PCR擴增
            2.2.2.4 T7EI檢測細胞基因組PCR產物
        2.2.3 TALEN對動物個體的基因編輯
            2.2.3.1 TALEN表達質粒體外轉錄mRNA
            2.2.3.2 顯微注射mRNA和胚胎移植
            2.2.3.3 F0代小鼠的突變檢測
    2.3 實驗結果
        2.3.1 TALEN載體構建
        2.3.2 TALEN對培養(yǎng)細胞的基因編輯
        2.3.3 TALEN對動物個體的基因編輯
            2.3.3.1 TALEN質粒體外轉錄mRNA
            2.3.3.2 mRNA注射和胚胎移植
            2.3.3.3 F0代小鼠的突變檢測
第三章 CRISPR/Cas9技術介導的FVⅢ基因敲除小鼠的制備
    3.1 實驗材料和試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 CRISPR/Cas9載體構建
            3.2.1.1 CRISPR/Cas9 gRNA設計
            3.2.1.2 CRISPR/Cas9載體構建
        3.2.2 CRISPR/Cas9對培養(yǎng)細胞的基因編輯
            3.2.2.1 細胞轉染
            3.2.2.2 突變檢測
            3.2.2.3 脫靶檢測
        3.2.3 CRISPR/Cas9對動物個體的基因編輯
            3.2.3.1 體外轉錄gRNA和Cas9 mRNA
            3.2.3.2 顯微注射mRNA和胚胎移植
            3.2.3.3 陽性小鼠檢測和T-A克隆測序
    3.3 實驗結果與分析
        3.3.1 載體構建
        3.3.2 CRISPR/Cas9對細胞基因組的編輯
        3.3.3 CRISPR/Cas9對小鼠基因組的編輯
            3.3.3.1 體外轉錄gRNA和Cas9 mRNA
            3.3.3.2 顯微注射mRNA和胚胎移植
            3.3.3.3 F0代小鼠的突變檢測
第四章 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的突變檢測與繁育
    4.1 實驗材料和試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的突變檢測
        4.2.2 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的繁育
    4.3 實驗結果與分析
        4.3.1 敲除小鼠后裔的突變檢測
        4.3.2 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的繁育
第五章 FVⅢ基因敲除小鼠的表型分析
    5.1 實驗材料和試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 凝血反應檢測
            5.2.1.1 活化部分凝血酶原時間(APTT)測定
            5.2.1.2 凝血酶原時間(PT)測定
        5.2.2 蛋白質免疫印跡檢測FVⅢ
    5.3 實驗結果
        5.3.1 FVⅢ基因敲除小鼠凝血途徑的檢測
        5.3.2 FVⅢ基因敲除小鼠的蛋白表達分析
第六章 討論與結論
    6.1 TALEN和CRISPR/Cas9技術比較
    6.2 胚胎胞質注射TALEN mRNA產生Mosaic小鼠的討論
    6.3 FVⅢ基因敲除小鼠表型分析探討
    6.4 結論
第七章 展望
附錄
參考文獻
在讀期間發(fā)表的學術論文及研究成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA.  遺傳學報. 2012(05)
[2]CRISPR-Cas系統(tǒng)與細菌和噬菌體的共進化[J]. 李鐵民,杜波.  遺傳. 2011(03)
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本文編號：3181192