人類甲型血友病是FVⅢ基因突變所產(chǎn)生的罕見遺傳性疾病。甲型血友病小鼠模型可用于該疾病的藥物研發(fā)、預(yù)防和治療手段等研究。已有基于ES同源重組制作的基因敲除小鼠模型,但該方法效率低、周期長、成本高。隨著ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展,尤其是TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)具有高效率、易操作、短周期、低費用等優(yōu)勢,成為應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù),使制備基因敲除小鼠模型更為便捷。本課題分別通過TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)敲除小鼠的FVⅢ基因,構(gòu)建甲型血友病小鼠模型。在細(xì)胞水平和動物個體上比較了兩種技術(shù)的效率,驗證了敲除的FVⅢ基因在后裔中傳遞的規(guī)律,并分析了基因敲除小鼠的表型。以小鼠FVⅢ基因第三外顯子為靶向,構(gòu)建TALEN核酸酶表達(dá)載體。細(xì)胞實驗顯示5對TALEN組合（T1-T5）中只有2對（T2、T5）發(fā)生基因編輯,突變率分別為16%和38%。動物實驗顯示將5對TALEN組合的mRNA分別注射至62、145、112、89、119枚胚胎,獲得57、140、92、81、114枚存活胚胎并移植至受體,出生10、39、26、0、28只小鼠。T7EI檢測和測序驗證... 

【文章來源】：南京師范大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因編輯技術(shù)
        1.1.1 基于ES打靶的同源重組技術(shù)
        1.1.2 核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)
            1.1.2.1 ZFN技術(shù)
            1.1.2.2 TALEN技術(shù)
            1.1.2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)
    1.2 FVⅢ與甲型血友病
        1.2.1 FVⅢ結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.2 甲型血友病
            1.2.2.1 甲型血友病的臨床表現(xiàn)
            1.2.2.2 甲型血友病的發(fā)病機制
    1.3 甲型血友病小鼠模型的研究意義
第二章 TALEN技術(shù)介導(dǎo)的FVⅢ基因敲除小鼠的制備
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗材料和試劑
        2.1.2 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 載體構(gòu)建
            2.2.1.1 設(shè)計TALEN識別序列
            2.2.1.2 載體構(gòu)建
        2.2.2 TALEN對培養(yǎng)細(xì)胞的基因編輯
            2.2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.2.2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取基因組
            2.2.2.3 提取細(xì)胞基因組進(jìn)行PCR擴增
            2.2.2.4 T7EI檢測細(xì)胞基因組PCR產(chǎn)物
        2.2.3 TALEN對動物個體的基因編輯
            2.2.3.1 TALEN表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄mRNA
            2.2.3.2 顯微注射mRNA和胚胎移植
            2.2.3.3 F0代小鼠的突變檢測
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 TALEN載體構(gòu)建
        2.3.2 TALEN對培養(yǎng)細(xì)胞的基因編輯
        2.3.3 TALEN對動物個體的基因編輯
            2.3.3.1 TALEN質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄mRNA
            2.3.3.2 mRNA注射和胚胎移植
            2.3.3.3 F0代小鼠的突變檢測
第三章 CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的FVⅢ基因敲除小鼠的制備
    3.1 實驗材料和試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
            3.2.1.1 CRISPR/Cas9 gRNA設(shè)計
            3.2.1.2 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
        3.2.2 CRISPR/Cas9對培養(yǎng)細(xì)胞的基因編輯
            3.2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            3.2.2.2 突變檢測
            3.2.2.3 脫靶檢測
        3.2.3 CRISPR/Cas9對動物個體的基因編輯
            3.2.3.1 體外轉(zhuǎn)錄gRNA和Cas9 mRNA
            3.2.3.2 顯微注射mRNA和胚胎移植
            3.2.3.3 陽性小鼠檢測和T-A克隆測序
    3.3 實驗結(jié)果與分析
        3.3.1 載體構(gòu)建
        3.3.2 CRISPR/Cas9對細(xì)胞基因組的編輯
        3.3.3 CRISPR/Cas9對小鼠基因組的編輯
            3.3.3.1 體外轉(zhuǎn)錄gRNA和Cas9 mRNA
            3.3.3.2 顯微注射mRNA和胚胎移植
            3.3.3.3 F0代小鼠的突變檢測
第四章 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的突變檢測與繁育
    4.1 實驗材料和試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的突變檢測
        4.2.2 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的繁育
    4.3 實驗結(jié)果與分析
        4.3.1 敲除小鼠后裔的突變檢測
        4.3.2 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的繁育
第五章 FVⅢ基因敲除小鼠的表型分析
    5.1 實驗材料和試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 凝血反應(yīng)檢測
            5.2.1.1 活化部分凝血酶原時間(APTT)測定
            5.2.1.2 凝血酶原時間(PT)測定
        5.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測FVⅢ
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 FVⅢ基因敲除小鼠凝血途徑的檢測
        5.3.2 FVⅢ基因敲除小鼠的蛋白表達(dá)分析
第六章 討論與結(jié)論
    6.1 TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)比較
    6.2 胚胎胞質(zhì)注射TALEN mRNA產(chǎn)生Mosaic小鼠的討論
    6.3 FVⅢ基因敲除小鼠表型分析探討
    6.4 結(jié)論
第七章 展望
附錄
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA.  遺傳學(xué)報. 2012(05)
[2]CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌和噬菌體的共進(jìn)化[J]. 李鐵民,杜波.  遺傳. 2011(03)
[3]小鼠基因修飾基本原理及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用——2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎及其相關(guān)工作介紹[J]. 湯富磊,馮娟.  生理科學(xué)進(jìn)展. 2008(03)
[4]DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]. 黃敏,繆澤鴻,丁健.  生理科學(xué)進(jìn)展. 2007(04)
[5]凝血因子Ⅷ結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 謝飛,王鴻利.  國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊. 2005(12)



本文編號：3181192