目的 :利用Cas9/RNA system gene targeting技術(shù)高效構(gòu)建Vash2基因敲除小鼠模型。方法 :根據(jù)Vash2基因序列,設(shè)計(jì)2對(duì)Vsah2基因的單鏈向?qū)NA（single-guide RNA,sg RNA）引物序列并克隆進(jìn)入p U57-T7-GDNA載體。利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄sg RNA和Cas9 m RNA。將體外轉(zhuǎn)錄的g RNA/Cas9 m RNA顯微注射入小鼠受精卵,通過PCR和基因測(cè)序?qū)ash2移碼突變進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突變情況。結(jié)果:順利構(gòu)建表達(dá)sg RNA載體并體外轉(zhuǎn)錄,成功將有活性的sg RNA和Cas9 m RNA直接注射入受精卵�；驕y(cè)序鑒定獲得5只F0代初建鼠。選取5號(hào)鼠與野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠。PCR顯示F2代鼠Vash2基因移碼突變,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并傳代繁育。結(jié)論:通過Cas9/RNA systemgene targeting技術(shù)可以成功制備Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具。 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2016,36(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板示意圖

sh2Vash2Vash2項(xiàng)目背景B6B6B6胚胎總數(shù)（枚）113115108表1顯微注射受精卵Table1Zygotemicroinjectioninvitro存活數(shù)（枚）887593移植數(shù)（枚）887593移植受體（只）334妊娠數(shù)（只）234出生小崽（只）071325存活數(shù)（只）0713242000bp1000bp500bp250bp2000bp1000bp500bp250bp檢測(cè)樣本數(shù)1～44。B6：對(duì)照組；M：DL2000Marker；1、2、3、5、7、19、33、39、40、42：漂移樣本；6、12、15、17、35、36：疑似漂移樣本；√：選取做基因測(cè)序的陽性鼠。圖4F0代基因敲除鼠PCR電泳結(jié)果Figure4ElectrophoreticresultsofF0knockoutmiceafterPCR編號(hào)010203053339刪除區(qū)域catcatgaccggctctgccgccgacactcaccg———tggctgcacgttgccaaggtccaccccagaccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccggctc———agggggagagatggtaggcgccatcagaagcccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccggc———acgttgccaaggtccaccccagagggggacgcccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccgg———ctctgaggttgggctgagccaaatccattaccgcccccttgccgtgtgcccctcatcatgacc———tgggagcggatgtggctgcacgttgccaaatgcctccccatccccgagtgcagctgggtgtg———gctgcacgttgccaaggtccaccccagag大小（bp）169216196429180483表2TA克隆測(cè)序結(jié)果Table2TAcloningandgenesequencingresults判定可移碼不能移碼可移碼可移碼不能移碼可移碼，翻譯起始上游序列同時(shí)也被部分刪除連接，成功構(gòu)建pU57-T7-GDNA-sgRNA載體。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列正確無誤。2．2獲得F0代Vash2基因敲除小鼠sgRNA表達(dá)載體pUC57-T7-GDNA-sgRNA和Cas9表達(dá)載體經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄，均勻混合sgRNA和Cas9mRNA至10ng／μL和20ng／μL，通過原核注射法顯微注射B6鼠

A：1號(hào)小鼠，Exon2共刪除－169bp，可以導(dǎo)致移碼突變；B：3號(hào)小鼠共刪除196bp，可以導(dǎo)致移碼突變；C：5號(hào)小鼠共刪除429bp，其中Exon2codingsequence區(qū)域刪除268bp，可以導(dǎo)致移碼突變；D：39號(hào)小鼠，共刪除483bp，Exon2coding區(qū)域刪除200bp，可以導(dǎo)致移碼突變。圖5測(cè)序鑒定F0代鼠1、3、5、39基因型分析結(jié)果Figure5GenesequencingandanalysisofF0knockoutmice（1，3，5，39）ABCD2．4建立Vash2敲除小鼠模型將上述經(jīng)鑒定過的F0鼠1（♂）、3（♂）、5（♀）、39（♀）與B6背景的野生型小鼠進(jìn)行回交獲得F1代。但我們主要選擇了Del429bp（Exon刪除268bp）的5（♀）號(hào)小鼠進(jìn)行繁育。原因是5號(hào)外顯子敲除片段較大，移碼突變結(jié)果較可靠。同樣的方法進(jìn)一步驗(yàn)證來自同一個(gè)5號(hào)的F1代雜合子互配獲得敲除Vash2基因的F2代純合子。隨機(jī)抽取F2代Vash2基因敲除小鼠進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示Vash2基因成功敲除（圖6）。代行龍，李偉，涂敏，等．應(yīng)用CRISPR／Cas9技術(shù)制備Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及驗(yàn)證［J］．南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，36（3）：323－329第36卷第3期2016年3月·327·

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]核型VASH2促進(jìn)人胚胎組織細(xì)胞的增殖研究[J]. 葛倩倩,涂敏,高文濤,苗毅.  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2015(05)



本文編號(hào)：3030710