本文關(guān)鍵詞：慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：移植物抗宿主病(GVHD)是發(fā)病率和病死率均高的異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)后并發(fā)癥。即使是由人類白細胞抗原(HLA)完全或基本相合的同胞作為供者,并且預(yù)防性地使用免疫抑制劑,仍然難以阻止GVHD的發(fā)生,并且GVHD會對剛剛經(jīng)歷過化療和allo-HSCT患者的生存質(zhì)量和生存率造成嚴重的影響。慢性移植物抗宿主病(cGVHD)為allo-HSCT后的遠期并發(fā)癥,有著發(fā)生率高、生存率低、嚴重影響患者生存質(zhì)量等特點。cGVHD復(fù)雜的發(fā)病機制尚未被充分了解,因此建立cGVHD動物模型以深入探索cGVHD顯得很有必要。目前國際上最常用的cGVHD動物模型為小鼠模型。根據(jù)模型表現(xiàn)和構(gòu)建方法的差異,可以將模型分為四類：硬皮病樣cGVHD小鼠模型,狼瘡樣cGVHD小鼠模型,狼瘡-硬皮病樣cGVHD小鼠模型和胸腺功能缺陷導致的cGVHD小鼠模型。這幾種模型并不是互相獨立的,但也各有特點。本文所擬建立的硬皮病樣cGVHD小鼠模型應(yīng)用廣泛,其特點為以類似于人類硬皮病的皮膚纖維化為特征,可累及肝、肺、唾液腺等器官,而以這類表現(xiàn)為主的cGVHD可出現(xiàn)在多達10%-15%的患者中。此模型的分子病理學基礎(chǔ)為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相合而有眾多的次要組織相容性抗原(miHA)不合。建立本模型的受鼠多需要接受致死劑量的全身放射(TBI),國外的范例之一為以B10.D2.為供鼠,以BALB/c為受鼠。T細胞被認為參與了cGVHD的形成和加重的全程。如果單純輸注供鼠的骨髓細胞(BMC)(幾乎不含T細胞)給受鼠,則不能發(fā)生cGVHD。因此,在建立cGVHD模型的過程中,一般會將供鼠來源的骨髓細胞與含有較高比例T細胞的脾細胞(SpC)混合后一起回輸給受鼠,從而誘發(fā)受鼠的cGVHD。改變脾細胞輸注量可能會影響移植物中T細胞的比例,從而影響cGVHD進程。而骨髓細胞中含有的間充質(zhì)干細胞和髓源抑制細胞等免疫抑制性細胞被逐漸發(fā)現(xiàn),提示了骨髓輸注可能會對cGVHD的進程有免疫抑制的效果。盡管有較多的構(gòu)建cGVHD小鼠模型的方案,但在構(gòu)建小鼠cGVHD模型中,還沒有關(guān)于改動骨髓與脾細胞輸注比例是否會對移植成功率和模型穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的研究。CD4+T細胞中有功能相異的兩大亞群——Th1細胞和Th2細胞。一些研究認為,Th1細胞主導了急性移植物抗宿主病(aGVHD),并且可能因分泌IFN-gamma、IL-2、IL-12等而誘發(fā)了細胞因子風暴,從而激活Th2細胞,通過IL-4、IL-5、IL-10等的作用,導致cGVHD的發(fā)生。研究表明Th1細胞相關(guān)的細胞因子通常在cGVHD時期表達較低,而同時Th2細胞相關(guān)的細胞因子卻在cGVHD進程中發(fā)揮著重要的作用,并有可能因此抑制了Th1、Th17等細胞的增殖和相關(guān)細胞因子的分泌,因為Th1和Th2細胞及其相關(guān)細胞因子之間通常呈拮抗作用。同時,IL-4、IL-5、IL-13等部分Th2細胞相關(guān)細胞因子被證明能夠刺激纖維母細胞增殖,促進膠原沉積,這些特性被證明與硬皮病樣cGVHD小鼠模型的特征性纖維化有著直接的關(guān)系。盡管Th1細胞主導的GVHD也能有同樣甚至更加猛烈的炎癥反應(yīng),但是Th1細胞分泌的細胞因子并不能使纖維母細胞增生并促進膠原的沉積,說明了上述纖維化表現(xiàn)只是由于受到Th2及其相關(guān)細胞因子的作用,而與Th1及其細胞因子無關(guān)。目的：建立一種能良好地模擬人類cGVHD的小鼠cGVHD模型,鑒定這種模型的臨床表現(xiàn)、病理學特征。在建立模型的過程中,了解骨髓細胞和脾細胞輸注量的改變對建模成功率和模型建成后較長時間內(nèi)cGVHD嚴重程度和穩(wěn)定性的影響,進而摸索得出建立這個小鼠cGVHD模型的理想骨髓細胞和脾細胞輸注量。模型的建立過程中,本文將探索模型隨時間進程而改變的病理學表現(xiàn)和Th細胞相關(guān)細胞因子變化情況,鑒定本模型發(fā)生發(fā)展的分子學機制,探討其在模擬人類cGVHD過程中的意義。方法：1. 將8-10周齡的雌性BALB/c小鼠(H-2d)隨機分為以下幾組作為受鼠,每組的脾細胞輸注量和骨髓細胞輸注量均有所不同：a) A組(骨髓細胞：脾細胞=8：91)：TBI后尾靜脈輸注骨髓細胞8×106,脾細胞9×106(n=20)；b) B組(骨髓細胞：脾細胞=6：91)：TBI后尾靜脈輸注骨髓細胞6×106,脾細胞9×106(n=5)；c) C組(骨髓細胞：脾細胞=8：8=1)：TBI后尾靜脈輸注骨髓細胞8×106,脾細胞8×106(n=5)；d) D組(骨髓細胞：脾細胞=6：81)：TBI后尾靜脈輸注骨髓細胞6×106,脾細胞8×106(n=5)；e) E組：TBI后尾靜脈輸注骨髓細胞8×106(n=5)；f) F組：TBI后無任何處理(n=5)；g) G組：無任何處理(n=5)在給受鼠做好移植前腸道準備(紅霉素250毫克/升,慶大霉素32萬單位/升,移植前7天開始并維持至移植后14天)的基礎(chǔ)上,取同樣8-10周齡的雄性B10.D2.(Hcl H-2d H2-T18c)小鼠作為供鼠,獲取供鼠的BMC和SpC并根據(jù)上述分組調(diào)整至事宜濃度,在受鼠接受完源皮距為100 cm,30cm×30 cm照射野,700 cGy,698跳,TBI處理后的4小時,經(jīng)由小鼠尾靜脈回輸給受鼠(F組TBI后不回輸細胞,G組不處理)。2.每日觀察小鼠,移植后前14天監(jiān)測小鼠白細胞計數(shù)以判斷植入是否成功,第14天開始按照臨床觀察評分表給小鼠評cGVHD分值并記錄,至少每3天的固定時刻評分一次。3.設(shè)置移植后第15天、第25天、第35天、第45天、第55天、第65天、第75天作為觀察點集中評價cGVHD臨床評分,第75天后處死所有小鼠(A組處死5只)。A組小鼠另外設(shè)置移植后第15天、第25天、第35天、第95天作為觀察點,每個觀察點處死3只小鼠并留取外周血血清,用LUMINEX試劑盒檢測Th細胞亞群相關(guān)的細胞因子水平。所有死亡或處死小鼠均留取組織病理標本。4.病理標本制作HE染色切片,并在鏡下根據(jù)cGVHD的病理評分標準評價cGVHD評分,超過2分才能視為發(fā)生了cGVHD。5.分析不同組的臨床cGVHD評分和cGVHD病理改變；分析不同觀察時間點的cGVHD病理改變和細胞因子水平變化。結(jié)果：1.移植后第8天,所有存活小鼠的白細胞計數(shù)皆大于1×109/L, A、C、E、G組小鼠存活100%,B、D組小鼠存活80%,F組全部死亡,死亡小鼠的死因是造血功能衰竭。第75天的A、B、C、D組的病理學結(jié)果表明這幾組中的所有小鼠(除前14天死亡的小鼠以外)均有cGVHD。A、C組小鼠的移植成功率優(yōu)于B組和D組(P0.05)。2.A組(骨髓細胞：脾細胞=8：91)、B組(骨髓細胞：脾細胞=6：91)D組(骨髓細胞：脾細胞=6：81)小鼠的cGVHD評分較高而穩(wěn)定,C組(骨髓細胞：脾細胞=8：8=1)小鼠的cGVHD評分從移植后第50天開始逐漸降低,即不能維持較強的cGVHD臨床表現(xiàn)。其評分在移植后第55天、第65天和第75天較其他組低(P0.05),在移植后第25天和第35天較A組低(P0.05)。C組的病理學改變較其他組輕(P0.05),尤其是皮膚的表現(xiàn)較為明顯。3.本模型的臨床表現(xiàn)以體重減輕,消瘦,脫毛,尾爪部腫脹、硬化、脫皮、結(jié)痂和潰瘍,排稀便,氣促和弓背等為主。A組小鼠移植后第15天的病理學改變中皮膚以炎性細胞浸潤為主,肺部有少許炎癥細胞浸潤；移植后第25天表現(xiàn)為皮膚以脂肪減少和炎性細胞浸潤為主,肺部結(jié)構(gòu)完好而炎癥細胞浸潤增加；移植后第35天表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)膠原纖維增生,伴有脂肪層萎縮和炎性細胞浸潤,肺部表現(xiàn)為基本肺結(jié)構(gòu)遭破壞,伴肺間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤；移植后第95天表現(xiàn)為皮膚膠原纖維增生明顯,毛囊大幅減少伴炎癥細胞浸潤,肺部基本肺結(jié)構(gòu)大片消失伴肺間質(zhì)纖維化和炎癥細胞浸潤。第95天的cGVHD病理評分高于第15天、第25天、第35天時的cGVHD病理評分(P0.05)。4. IFN-gamma(P0.05)、IL-lbeta(P0.05)、IL-2、IL-17A等Th1、Th17相關(guān)的細胞因子在第15天后含量下降,GM-CSF、IL-12p70等Th1、Th17相關(guān)的細胞因子在cGVHD進程中變化不明顯。而IL-4、IL-5(P0.05)等Th2細胞相關(guān)的細胞因子隨cGVHD進展而含量升高(P0.05)。結(jié)論：成功建立了小鼠cGVHD模型B10.D2.(Hcl H-2d H2-T18c)→BALB/c (H-2d)。本模型以纖維化所致的表現(xiàn)為主,主要累及皮膚和肺,也累及消化道等器官。模型在移植后第8天恢復(fù)造血,cGVHD進程中靶器官受損由早期的炎癥細胞浸潤為主向膠原沉積為主轉(zhuǎn)變。本模型cGVHD嚴重程度與骨髓細胞和脾細胞的比例有關(guān),當骨髓細胞：脾細胞的比例小于1時,可以獲得穩(wěn)定、持續(xù)且較嚴重的cGVHD小鼠模型。而當骨髓細胞：脾細胞=1時,所得到的小鼠cGVHD模型疾病表現(xiàn)相對較弱。本研究結(jié)果推薦在建模時給每只受鼠回輸8×106骨髓細胞及9×106脾細胞。這能在提高建模成功率的同時,保證維持cGVHD強度。本模型是以Th2細胞相關(guān)的細胞因子為主導的,以組織器官纖維化為特征的小鼠cGVHD模型,并能較好模擬部分臨床cGVHD進程和細胞因子表達情況。
【關(guān)鍵詞】：慢性移植物抗宿主病 模型 骨髓細胞 脾細胞 纖維化 Th2細胞
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R-332;R457.7
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 前言19-31
• 第一節(jié) 慢性移植物抗宿主病19-23
• 第二節(jié) 慢性移植物抗宿主病小鼠模型23-31
• 第二章 材料和方法31-44
• 第一節(jié) 動物來源和動物實驗場地31
• 第二節(jié) 主要試劑和耗材31-35
• 第三節(jié) 實驗方法35-43
• 第四節(jié) 統(tǒng)計學分析43-44
• 第三章 實驗結(jié)果44-57
• 第一節(jié) 脾細胞和骨髓細胞輸注量的變化對本模型中小鼠cGVHD嚴重程度的影響44-49
• 第二節(jié) A組小鼠移植后不同時間點cGVHD病理學改變49-52
• 第三節(jié) T細胞亞群相關(guān)細胞因子在cGVHD進程中的改變52-57
• 第四章 討論57-65
• 第五章 結(jié)論65-66
• 參考文獻66-74
• 附錄74-76
• 成果76-77
• 致謝77-79

【參考文獻】

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1 李海霞;MHC相合造血干細胞移植后cGVHD小鼠模型的實驗研究[D];山西醫(yī)科大學;2010年

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本文編號：301990