本文關(guān)鍵詞：HIV-1單價(jià)抗體的構(gòu)建與活性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中和抗體是人體內(nèi)保護(hù)性免疫反應(yīng)的重要組成部分,因此找到具有廣譜中和活性的單克隆抗體對(duì)治療HIV-1以及疫苗的研究有重要的意義。由于HIV病毒的高度變異性,只用一種抗體作用病毒,病毒很容易發(fā)生逃逸,因而達(dá)不到理想的治療效果,同時(shí)使用幾種中和抗體,可明顯提高其中和效率。然而抗體分子量較大,可能會(huì)出現(xiàn)由于幾種抗體同時(shí)結(jié)合病毒顆粒表面時(shí)的空間位阻影響其中和活性。文獻(xiàn)報(bào)道,單價(jià)抗體能很好地保持抗體的抗原結(jié)合活性,但分子量較小。將多種單價(jià)抗體混合使用,有可能達(dá)到既發(fā)揮多種抗體的中和活性,又能不造成過大的空間位阻作用。文獻(xiàn)報(bào)道的單價(jià)抗體,主要有兩種:一種為完整的重鏈、輕鏈以及N端截短型的重鏈分子組成的包含1個(gè)Fab和1個(gè)Fc的N端截短型的單價(jià)IgG(N-terminally truncated humanIgG,IgG-tH);另一種為一條重鏈和1條輕鏈組成的半分子型單價(jià)抗體(IgG half molecule,IgG-HM)的重鏈。本文以已知的HIV-1中和抗體2G12為模型,構(gòu)建了以上兩種不同的單價(jià)抗體,并對(duì)其結(jié)合活性和中和活性進(jìn)行了比較,希望能找到一種既能很好保持抗體活性又易于制備的單價(jià)抗體構(gòu)建方案,并以此方案構(gòu)建多種單價(jià)抗體,進(jìn)一步對(duì)單價(jià)抗體的結(jié)合活性、中和活性及其在兩種單抗聯(lián)合應(yīng)用中的效果進(jìn)行了研究。本文首先以2G12抗體重鏈基因?yàn)槟０?構(gòu)建了表達(dá)N端截短型的IgG重鏈和半分子型單價(jià)抗體兩種構(gòu)型的單價(jià)抗體的表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),之后進(jìn)行了純化。對(duì)純化后的兩種抗體進(jìn)行非還原SDS-PAGE,染色結(jié)果顯示,兩種單價(jià)抗體均成功表達(dá)。體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明兩種單價(jià)抗體與親本單抗在結(jié)合活性方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外微量中和實(shí)驗(yàn)表明單價(jià)抗體基本保持了親本抗體的中和活性,且兩種構(gòu)建體2G12-tH和2G12-HM無明顯差異,但半分子型單價(jià)抗體更易于制備純化。以2G12-HM型抗體的重鏈恒定區(qū)為基礎(chǔ),替換不同的已知單抗的重鏈可變區(qū),并進(jìn)行表達(dá),共成功得到11種HM型單價(jià)抗體。對(duì)獲得的11種單價(jià)抗體在25μg/mL的濃度下用9種不同的假病毒做體外中和試驗(yàn),檢測(cè)其中和活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有兩種原型IgG未檢測(cè)到中和活性的抗體(DF07-2A5和DF07-2G5),其HM分子對(duì)假病毒TRO.11檢測(cè)到明顯的中和活性,其余的單抗原型IgG有很好中和作用的其單價(jià)抗體的中和活性也很強(qiáng),而原型IgG沒有中和活性的抗體其單價(jià)抗體也未檢測(cè)到中和活性。其后我們又對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的具有廣譜中和活性的三株單抗(VRC01、NIH45-46、PG9)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。分別比較了原型IgG和單價(jià)抗體的結(jié)合活性、抗體親和力、中和活性以及他們與未檢測(cè)到或中和活性較弱的單抗聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)這些抗體的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與原型IgG相比,單價(jià)抗體的結(jié)合活性和親和力無明顯差異,但在中和活性方面,不同的抗體改造前后的中和活性變化有所不同,其中VRC01-HM抗體對(duì)9種假病毒中的5種的中和活性有2倍以上的提高,余下4種差異不大;PG9-HM和NIH45-46-HM對(duì)假病毒的中和活性有減弱、增強(qiáng)和無明顯差異三種不同表現(xiàn)。但在對(duì)這三種單抗進(jìn)行兩兩組合對(duì)不同假病毒進(jìn)行的體外中和實(shí)驗(yàn)中,HM型單價(jià)抗體對(duì)病毒的中和活性明顯強(qiáng)于其原型IgG組合,主要表現(xiàn)在HM型抗體組合的IC50值普遍低于對(duì)應(yīng)的IgG組合,且觀察到協(xié)同或相加作用的實(shí)驗(yàn)組合明顯增多,在HM和IgG組分別為40.7%和22.2%。NIH45-46-HM與PG9-HM抗體的組合對(duì)9種假病毒中的6種具有協(xié)同或相加的中和作用,而IgG組合只對(duì)其中的2種觀察到類似作用。在沒有檢測(cè)到中和活性或中和活性很弱的7種抗體與VRC-01-HM抗體和NIH-4546-HM抗體聯(lián)合應(yīng)用對(duì)假病毒的中和實(shí)驗(yàn)中,聯(lián)合應(yīng)用后的中和活性均明顯強(qiáng)于抗體單獨(dú)應(yīng)用。綜上所述,通過對(duì)IgG抗體重鏈恒定區(qū)進(jìn)行改造,成功獲得了半分子型單價(jià)抗體。與原型IgG相比,IgG-HM的結(jié)合活性及與抗原的親和力無明顯變化;在中和活性方面,在單獨(dú)應(yīng)用時(shí)不同的單抗對(duì)不同病毒的中和活性有所不同,但在兩種單抗聯(lián)合應(yīng)用時(shí),其中和活性明顯強(qiáng)于IgG分子的組合,為單價(jià)抗體在HIV-1治療或預(yù)防中的應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：人類免疫缺陷病毒 單價(jià)抗體 中和活性 結(jié)合活性
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 主要英文縮寫詞4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-18
• 1.1 HIV特點(diǎn)12-14
• 1.2 艾滋病疫苗研究進(jìn)展14-15
• 1.3 中和抗體15-16
• 1.4 課題背景16-17
• 1.5 本研究的內(nèi)容和意義17-18
• 第2章 HIV-1 特異性單抗 2G12單價(jià)抗體的構(gòu)建及活性分析18-30
• 2.1 引言18
• 2.2 材料18-20
• 2.2.1 細(xì)胞18
• 2.2.2 假病毒18-19
• 2.2.3 試劑以及相關(guān)溶液配制19
• 2.2.4 質(zhì)粒19-20
• 2.2.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器20
• 2.3 方法20-26
• 2.3.1 抗體基因改造20-23
• 2.3.2 單價(jià)抗體的制備與純化23-24
• 2.3.3 抗體分子的SDS-PAGE鑒定24
• 2.3.4 ELISA法檢測(cè)抗體特異性24-25
• 2.3.5 單價(jià)抗體的中和活性分析25-26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-28
• 2.4.1 抗體改造與克隆26-27
• 2.4.2 抗體的表達(dá)27
• 2.4.3 ELISA法檢測(cè)抗體特異性27-28
• 2.4.4 單克隆抗體中和活性分析28
• 2.5 討論28-29
• 2.6 本章小結(jié)29-30
• 第3章 HIV-1 單價(jià)抗體的構(gòu)建與篩選30-46
• 3.1 引言30
• 3.2 材料30-31
• 3.2.1 細(xì)胞30
• 3.2.2 假病毒30
• 3.2.3 試劑30-31
• 3.2.4 抗體31
• 3.2.5 實(shí)驗(yàn)儀器31
• 3.3 方法31-35
• 3.3.1 半分子型單價(jià)抗體重鏈基因表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建31-32
• 3.3.2 單價(jià)抗體的制備與純化32
• 3.3.3 抗體分子的SDS-PAGE鑒定32
• 3.3.4 單價(jià)抗體結(jié)合活性測(cè)試32-33
• 3.3.5 單價(jià)抗體的親和力測(cè)定33
• 3.3.6 單價(jià)抗體與其IgG原型的中和作用比較33-34
• 3.3.7 不同單抗組合中和活性分析34
• 3.3.8 篩選后的單價(jià)抗體對(duì)低效單價(jià)抗體的加強(qiáng)作用檢測(cè)34-35
• 3.4 結(jié)果35-43
• 3.4.1 抗體表達(dá)與純化35-36
• 3.4.2 單價(jià)抗體結(jié)合活性分析36-37
• 3.4.3 單價(jià)抗體的親和力檢測(cè)37-39
• 3.4.4 單價(jià)抗體中和活性分析39-41
• 3.4.5 單價(jià)抗體與其IgG原型的中和相互作用比較41-42
• 3.4.6 亞中和劑量的VRC01-HM和NIH45-46HM對(duì)其他單價(jià)抗體的中和活性影響42-43
• 3.5 討論43-45
• 3.6 本章小結(jié)45-46
• 結(jié)論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文53-54
• 致謝54

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1 馮一帆;HIV-1單價(jià)抗體的構(gòu)建與活性分析[D];北京工業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：HIV-1單價(jià)抗體的構(gòu)建與活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：300446