本文關鍵詞：HIV-1單價抗體的構建與活性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中和抗體是人體內(nèi)保護性免疫反應的重要組成部分,因此找到具有廣譜中和活性的單克隆抗體對治療HIV-1以及疫苗的研究有重要的意義。由于HIV病毒的高度變異性,只用一種抗體作用病毒,病毒很容易發(fā)生逃逸,因而達不到理想的治療效果,同時使用幾種中和抗體,可明顯提高其中和效率。然而抗體分子量較大,可能會出現(xiàn)由于幾種抗體同時結(jié)合病毒顆粒表面時的空間位阻影響其中和活性。文獻報道,單價抗體能很好地保持抗體的抗原結(jié)合活性,但分子量較小。將多種單價抗體混合使用,有可能達到既發(fā)揮多種抗體的中和活性,又能不造成過大的空間位阻作用。文獻報道的單價抗體,主要有兩種:一種為完整的重鏈、輕鏈以及N端截短型的重鏈分子組成的包含1個Fab和1個Fc的N端截短型的單價IgG(N-terminally truncated humanIgG,IgG-tH);另一種為一條重鏈和1條輕鏈組成的半分子型單價抗體(IgG half molecule,IgG-HM)的重鏈。本文以已知的HIV-1中和抗體2G12為模型,構建了以上兩種不同的單價抗體,并對其結(jié)合活性和中和活性進行了比較,希望能找到一種既能很好保持抗體活性又易于制備的單價抗體構建方案,并以此方案構建多種單價抗體,進一步對單價抗體的結(jié)合活性、中和活性及其在兩種單抗聯(lián)合應用中的效果進行了研究。本文首先以2G12抗體重鏈基因為模板,構建了表達N端截短型的IgG重鏈和半分子型單價抗體兩種構型的單價抗體的表達載體,并轉(zhuǎn)染293T細胞進行表達,之后進行了純化。對純化后的兩種抗體進行非還原SDS-PAGE,染色結(jié)果顯示,兩種單價抗體均成功表達。體外結(jié)合實驗證明兩種單價抗體與親本單抗在結(jié)合活性方面差異無統(tǒng)計學意義。體外微量中和實驗表明單價抗體基本保持了親本抗體的中和活性,且兩種構建體2G12-tH和2G12-HM無明顯差異,但半分子型單價抗體更易于制備純化。以2G12-HM型抗體的重鏈恒定區(qū)為基礎,替換不同的已知單抗的重鏈可變區(qū),并進行表達,共成功得到11種HM型單價抗體。對獲得的11種單價抗體在25μg/mL的濃度下用9種不同的假病毒做體外中和試驗,檢測其中和活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有兩種原型IgG未檢測到中和活性的抗體(DF07-2A5和DF07-2G5),其HM分子對假病毒TRO.11檢測到明顯的中和活性,其余的單抗原型IgG有很好中和作用的其單價抗體的中和活性也很強,而原型IgG沒有中和活性的抗體其單價抗體也未檢測到中和活性。其后我們又對文獻報道的具有廣譜中和活性的三株單抗(VRC01、NIH45-46、PG9)進行了進一步的研究。分別比較了原型IgG和單價抗體的結(jié)合活性、抗體親和力、中和活性以及他們與未檢測到或中和活性較弱的單抗聯(lián)合應用時對這些抗體的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與原型IgG相比,單價抗體的結(jié)合活性和親和力無明顯差異,但在中和活性方面,不同的抗體改造前后的中和活性變化有所不同,其中VRC01-HM抗體對9種假病毒中的5種的中和活性有2倍以上的提高,余下4種差異不大;PG9-HM和NIH45-46-HM對假病毒的中和活性有減弱、增強和無明顯差異三種不同表現(xiàn)。但在對這三種單抗進行兩兩組合對不同假病毒進行的體外中和實驗中,HM型單價抗體對病毒的中和活性明顯強于其原型IgG組合,主要表現(xiàn)在HM型抗體組合的IC50值普遍低于對應的IgG組合,且觀察到協(xié)同或相加作用的實驗組合明顯增多,在HM和IgG組分別為40.7%和22.2%。NIH45-46-HM與PG9-HM抗體的組合對9種假病毒中的6種具有協(xié)同或相加的中和作用,而IgG組合只對其中的2種觀察到類似作用。在沒有檢測到中和活性或中和活性很弱的7種抗體與VRC-01-HM抗體和NIH-4546-HM抗體聯(lián)合應用對假病毒的中和實驗中,聯(lián)合應用后的中和活性均明顯強于抗體單獨應用。綜上所述,通過對IgG抗體重鏈恒定區(qū)進行改造,成功獲得了半分子型單價抗體。與原型IgG相比,IgG-HM的結(jié)合活性及與抗原的親和力無明顯變化;在中和活性方面,在單獨應用時不同的單抗對不同病毒的中和活性有所不同,但在兩種單抗聯(lián)合應用時,其中和活性明顯強于IgG分子的組合,為單價抗體在HIV-1治療或預防中的應用提供了可靠的實驗依據(jù)。
【關鍵詞】：人類免疫缺陷病毒 單價抗體 中和活性 結(jié)合活性
【學位授予單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 主要英文縮寫詞4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-18
• 1.1 HIV特點12-14
• 1.2 艾滋病疫苗研究進展14-15
• 1.3 中和抗體15-16
• 1.4 課題背景16-17
• 1.5 本研究的內(nèi)容和意義17-18
• 第2章 HIV-1 特異性單抗 2G12單價抗體的構建及活性分析18-30
• 2.1 引言18
• 2.2 材料18-20
• 2.2.1 細胞18
• 2.2.2 假病毒18-19
• 2.2.3 試劑以及相關溶液配制19
• 2.2.4 質(zhì)粒19-20
• 2.2.5 主要實驗儀器20
• 2.3 方法20-26
• 2.3.1 抗體基因改造20-23
• 2.3.2 單價抗體的制備與純化23-24
• 2.3.3 抗體分子的SDS-PAGE鑒定24
• 2.3.4 ELISA法檢測抗體特異性24-25
• 2.3.5 單價抗體的中和活性分析25-26
• 2.4 實驗結(jié)果26-28
• 2.4.1 抗體改造與克隆26-27
• 2.4.2 抗體的表達27
• 2.4.3 ELISA法檢測抗體特異性27-28
• 2.4.4 單克隆抗體中和活性分析28
• 2.5 討論28-29
• 2.6 本章小結(jié)29-30
• 第3章 HIV-1 單價抗體的構建與篩選30-46
• 3.1 引言30
• 3.2 材料30-31
• 3.2.1 細胞30
• 3.2.2 假病毒30
• 3.2.3 試劑30-31
• 3.2.4 抗體31
• 3.2.5 實驗儀器31
• 3.3 方法31-35
• 3.3.1 半分子型單價抗體重鏈基因表達表達質(zhì)粒的構建31-32
• 3.3.2 單價抗體的制備與純化32
• 3.3.3 抗體分子的SDS-PAGE鑒定32
• 3.3.4 單價抗體結(jié)合活性測試32-33
• 3.3.5 單價抗體的親和力測定33
• 3.3.6 單價抗體與其IgG原型的中和作用比較33-34
• 3.3.7 不同單抗組合中和活性分析34
• 3.3.8 篩選后的單價抗體對低效單價抗體的加強作用檢測34-35
• 3.4 結(jié)果35-43
• 3.4.1 抗體表達與純化35-36
• 3.4.2 單價抗體結(jié)合活性分析36-37
• 3.4.3 單價抗體的親和力檢測37-39
• 3.4.4 單價抗體中和活性分析39-41
• 3.4.5 單價抗體與其IgG原型的中和相互作用比較41-42
• 3.4.6 亞中和劑量的VRC01-HM和NIH45-46HM對其他單價抗體的中和活性影響42-43
• 3.5 討論43-45
• 3.6 本章小結(jié)45-46
• 結(jié)論46-48
• 參考文獻48-53
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文53-54
• 致謝54

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 齊劍英;郭茉;葉賢龍;闞方明;張宇;郝智超;徐黎明;任桂萍;王文飛;李德山;;scBsAb1/17雙特異性抗體對小鼠類風濕性關節(jié)炎模型的治療效果[J];中國藥理學通報;2013年03期

2 ;[J];;年期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮一帆;HIV-1單價抗體的構建與活性分析[D];北京工業(yè)大學;2015年

  本文關鍵詞：HIV-1單價抗體的構建與活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：300446