目的制備攜帶螢火蟲熒光素酶報告基因的腸道病毒D組68型（enterovirus D68,EV-D68）假病毒。方法分別構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白報告基因的EV-D68表達(dá)子和攜帶螢光蟲熒光素酶報告基因的EV-D68復(fù)制子,共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后收獲EV-D68假病毒;實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription PCR,RT-PCR）及蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）鑒定EV-D68假病毒;實時熒光定量PCR檢測假病毒滴度,熒光強度定量檢測假病毒感染活性。結(jié)果成功構(gòu)建EV-D68表達(dá)子和復(fù)制子;成功制備EV-D68假病毒,RT-PCR和Western blotting結(jié)果表明其具有螢火蟲熒光素酶報告基因和與活病毒相同的衣殼蛋白,拷貝數(shù)為（4～8）×106copies/m L,熒光強度與假病毒感染劑量呈正相關(guān),證明其具有感染活性。結(jié)論成功構(gòu)建了EV-D68假病毒。 

【文章來源】：微生物學(xué)免疫學(xué)進展. 2019,47(06)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

腸道病毒結(jié)構(gòu)以及EV-D68假病毒構(gòu)建原理示意圖[1]

酶切條帶大小與預(yù)期相符。最后測序的結(jié)果顯示，對應(yīng)匹配率100%，見圖2。將構(gòu)建的EV-D68衣殼蛋白表達(dá)子轉(zhuǎn)染細(xì)胞，由于載體構(gòu)建時EGFP位于P1之前，因此EGFP表達(dá)強度可以衡量P1表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染后EGFP的表達(dá)效率超過80%，表明該質(zhì)粒可正常表達(dá)，見圖3。

將構(gòu)建的EV-D68衣殼蛋白表達(dá)子轉(zhuǎn)染細(xì)胞，由于載體構(gòu)建時EGFP位于P1之前，因此EGFP表達(dá)強度可以衡量P1表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染后EGFP的表達(dá)效率超過80%，表明該質(zhì)粒可正常表達(dá)，見圖3。2.2 假病毒復(fù)制子的構(gòu)建和鑒定

【參考文獻】：
期刊論文
[1]手足口病假病毒中和抗體檢測平臺的建立和初步應(yīng)用[J]. 吳星,董方玉,蘇瑤,陳盼,梁爭論.  中國病毒病雜志. 2018(06)
[2]柯薩奇病毒A組6型報告基因假病毒可視化感染模型的建立[J]. 吳星,蘇瑤,董方玉,陳盼,李克雷,高帆,卞蓮蓮,孫世洋,胡亞林,毛群穎,梁爭論.  中國病毒病雜志. 2018(06)
[3]柯薩奇病毒A組16型中和抗體假病毒熒光定量檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 郝曉甜,陳盼,毛群穎,邵杰,林惠娟,羅震,吳星,梁爭論.  中國病毒病雜志. 2016(01)



本文編號：2974837