發(fā)布時(shí)間：2021-01-13 07:03

　　目的:觀察成肌分化過(guò)程中C2C12細(xì)胞Lrtm1表達(dá);構(gòu)建小鼠Lrtm1慢病毒過(guò)表達(dá)載體;篩選穩(wěn)定表達(dá)外源Lrtm1細(xì)胞株誘導(dǎo)其分化后觀察對(duì)成肌分化標(biāo)志基因Myogenin、Myosin的影響;發(fā)現(xiàn)Lrtm1蛋白質(zhì)表達(dá)水平受調(diào)控的機(jī)制。方法:誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化用Hoechst染色細(xì)胞核;將小鼠Lrtm1基因連接到慢病毒載體質(zhì)粒pLJM1-GFP上并進(jìn)行慢病毒包裝;篩選穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Lrtm1基因的C2C12細(xì)胞系,誘導(dǎo)分化Lrtm1-DDK組、GFP組檢測(cè)對(duì)成肌分化標(biāo)志基因Myogenin、Myosin表達(dá)的影響;MG132處理C2C12-Lrtm1-DDK細(xì)胞系后,觀察內(nèi)源性Lrtm1蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果:誘導(dǎo)分化過(guò)程中,肌管形成,Lrmt1、Myosin mRNA水平隨分化的進(jìn)行表達(dá)上升;成功構(gòu)建重組pLJM1-Lrtm1-DDK表達(dá)載體;成功篩選穩(wěn)定表達(dá)外源Lrtm1細(xì)胞株;誘導(dǎo)穩(wěn)定細(xì)胞系分化后,real-time PCR在144 h時(shí)顯示Lrtm1-DDK組（272.1±18.22）Myogenin mRNA水平較GFP組（332.41±41.21）減少（P<0.05）;Lr... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2018,43(10)北大核心

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【部分圖文】：

kb1kb1234567891011B.pLJM1-GFP載體酶切電泳

s；55℃20s；60℃5s；40個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，使用2-△△Ct計(jì)算相對(duì)mRNA含量，△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因GAPDH），△△Ct=△Ct（實(shí)驗(yàn)組）-△Ct（對(duì)照組），2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組目的基因mRNA含量相對(duì)對(duì)照組改變的倍數(shù)。各基因引物序列見(jiàn)表1。1.2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建為進(jìn)一步研究Lrtm1基因在成肌分化過(guò)程中的作用，本研究決定構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Lrtm1的細(xì)胞株。將目的基因Lrtm1進(jìn)行擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1164bp，與理論計(jì)算長(zhǎng)度相同（圖1A）。pLJM1-GFP載體用AgeⅠ、EcoRⅠ內(nèi)切酶（37℃，60min）酶切進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示pLJM1載體雙酶切后出現(xiàn)的各個(gè)片段與理論計(jì)算的條帶相符（圖1B）。連接轉(zhuǎn)化后挑選8個(gè)單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1~6號(hào)，8號(hào)克隆成功連接Lrtm1基因（圖1C）。表1各基因引物序列基因引物序列序列長(zhǎng)度（bp）Lrtm1DDKMyogeninMyosinGAPDHF：5-TGTTGAATGAGGGTTTGTGCT-3R：5-TCCACGGAGTTTGATGATGG-3F：5-TGAGAAGATGGGAAGTAAGG-3R：5-CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGT-3F：5-CTGACCCTACAGACGCCCAC-3R：5-TGTCCACGATGGACGTAAGG-3F：5-CCAAGGGCCTGAATGAGGAG-3R：5-GCAAAGGCTCCAGGTCTGAG-3F：5-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3R：5-AGTTGGGATAGGGCCTCTCTTG-31391421621531501：Marker；2：陰性對(duì)照；3：PCR產(chǎn)物A.Lrtm1基因PCR產(chǎn)物電泳鑒定B.pLJM1-GFP載體酶切電泳圖1：Marker；2：陽(yáng)性對(duì)照；3：陰性對(duì)照；4~11：?jiǎn)慰寺【銫.陽(yáng)性克隆PCR鑒定圖1重組質(zhì)粒的構(gòu)建4kb3kb2kb1kb1233kb2kb1kbAgeⅠEcoRⅠ--+++-+-3kb2kb1kb1234567891011—1293—

重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2018年第43卷第10期（JournalofChongqingMedicalUniversity2018.Vol.43No.10）圖3重組質(zhì)粒pLJM1-Lrtm1-DDK在293T細(xì)胞中的表達(dá)P=0.000）。誘導(dǎo)分化上述2株穩(wěn)定細(xì)胞株0、96、120、144h后，收取細(xì)胞檢測(cè)Lrtm1mRNA表達(dá)水平（圖4C）。以GFP組為對(duì)照，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Lrtm1-DDK組的Lrtm1mRNA水平分別為GFP組的（72.3±10.76）×102、（79.23±12.33）×102、（127.41±8.75）×102、（140±12.1）×102倍。方差分析Lrtm1mRNA表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=93.450，P=0.000）。Lrtm1-DDK組間兩兩比較，96h組較0h組增加（tD=9.792，P=0.000），120h組較96h組增加（tD=15.750，P=0.000），144h組較120h組增加（tD=17.300，P=0.000）。結(jié)果顯示：Lrtm1-DDK組隨誘導(dǎo)分化時(shí)間延長(zhǎng)Lrtm1mRNA水平在0h過(guò)表達(dá)的水平上繼續(xù)升高。2.3.2qRT-PCR檢測(cè)Myogenin、MyosinmRNA水平表達(dá)誘導(dǎo)分化上述2株穩(wěn)定細(xì)胞株0、96、120、144h后，收取細(xì)胞檢測(cè)Myogenin、MyosinmRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖5A、B所示，檢測(cè)MyogeninmRNA表達(dá)水平，在144h時(shí)Lrtm1-DDK組（272.1±18.22）較GFP組（332.41±41.21）減少（P＜0.05），MyosinmRNA水平在分化144h時(shí)Lrtm1-DDK組（76.11±10.47）較GFP組（145.51±10.02）明顯減少（P＜0.05）。a：與0h組比較P=0.000；b：與48h組比較P=0.000；c：與72h組比較P=0.000A.qRT-PCR檢測(cè)MyosinmRNA水平表達(dá)h48h72h96h0a：與0h組比較P=0.000；b：與0h組比較P=0.000；c：與0h組比較P=0.000B.qRT-PCR檢測(cè)Lrtm1mRNA水平表達(dá)圖2誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞分化在檢測(cè)Lrtm1、MyosinmRNA水平表達(dá)0487296（h）acaba100101MyosinmRAN相對(duì)表達(dá)量0487296（h）110100Lrtm1mRAN相對(duì)表達(dá)量aabacLr


本文編號(hào)：2974436