人臍帶血間充質干細胞通過抑制MEK/ERK通路改善LPS誘導的AECⅡ凋亡機制的研究
發(fā)布時間：2020-12-25 16:23
目的探討人臍帶血間充質干細胞（hUC-MSC）對脂多糖（LPS）誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）凋亡的影響,及MEK/ERK信號通路在其中的作用。方法采用LPS與A549細胞共培養(yǎng)建立AECⅡ凋亡模型;將凋亡模型按隨機數字表法分成6組,分別與MSC條件培養(yǎng)基（MSC-CM）、MEK/ERK通路抑制劑（PD98059）及PBS體外共培養(yǎng),分別為A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+LPS+PD98059,陰性對照組為A549+PBS、A549+MSC、A549+PD98059,48 h后采用流式細胞術檢測A549細胞凋亡情況;對MEK/ERK通路及凋亡相關信號（BAX/BCL-2、FAS、caspase 3及caspase 8）進行qPCR檢測,對A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+PBS、A549+MSC四組組進行Western blot檢測。結果建立A549+LPS凋亡模型。A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059組與A549+LPS+PBS比較,凋亡率顯著下降。A549+LPS+MSC及A549+LPS+PD98...
【文章來源】：中國醫(yī)藥導報. 2020年06期
【文章頁數】：6 頁
【部分圖文】：
Western blot檢測MEK/ERK通路及凋亡相關信號表達
MEK/ERK是Ras絲裂原信號轉導下游的核心元件，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，當細胞外刺激物（如LPS、細胞因子）與相應受體結合后，SOS與受體或受體底物上的酪氨酸（Tyr）磷酸化位點結合，在Ras附近形成高濃度的SOS，其促使GTP取代Ras上的GDP而活化Ras，使MEK催化區(qū)中Thr和Ser磷酸化激活MEK，發(fā)揮調控細胞凋亡的作用[16-17]。根據之前本課題組研究發(fā)現的膿毒癥所致ARDS中AECⅡ凋亡的機制與MEK/ERK磷酸化相關[8]，結合此次體外研究結果，即在LPS誘導A549凋亡模型中，p-MEK/p-ERK蛋白表達增高，本研究認為可能是LPS激活Ras/MEK/ERK信號通路，促進MEK和ERK磷酸化，進而導致細胞色素C的大量釋放，形成凋亡體后激活caspase 3，爆發(fā)級聯反應，最終導致AECⅡ凋亡[18-19]。MSC通過旁分泌各種生長因子，彌補損傷情況下生物多樣性重要成分，發(fā)揮調節(jié)如NF-κB、PI3K/AKT等重要信號通路的活性，從而改善凋亡的作用[9,20]。本研究結果發(fā)現，通過MSC-CM及PD98059與LPS誘導A549共培養(yǎng)，A549凋亡情況均改善，同時MSC與PD98059一致，其Bax/Bcl-2、Fas及MEK、MRK在基因水平與對照組存在明顯差異。且經MSC及PD98059干預后，Bax/bal-2的比例及caspase 3也較對照組明顯下調。結合MSC干預組的BAX和FAS在蛋白水平的表達上顯著低于對照組，且p-MEK和pERK的蛋白表達同樣弱于對照組，充分說明MSC極有可能是通過抑制MEK/ERK信號通路的磷酸化，從而抑制AECⅡ的凋亡，但其上游相關信號（Raf/Ras）如何調控MEK/ERK的活化尚需進一步的驗證。
Annexin-V-FITC/PI染色流式細胞術檢測各組細胞凋亡結果，如圖1所示，因隨著LPS濃度繼續(xù)增大，A549細胞以壞死為主[15]，故采用LPS(20μg/mL）建立誘導A549凋亡模型。2.2 hUC-MSC和PD98059干預后對LPS誘導的A549凋亡影響
【參考文獻】：
期刊論文
[1]參附注射液對膿毒癥小鼠免疫調節(jié)及炎癥因子的影響[J]. 趙鋒利,冼紹祥,羅苑苑,王澍欣,徐運升,林新峰. 中國醫(yī)藥導報. 2019(22)
[2]UC-MSC經PI3K/AKT信號通路影響人肺腺癌A549細胞的凋亡和增殖[J]. 袁哲,吳思夢,王亞君,王思亮,朱喜科. 中國腫瘤生物治療雜志. 2019(03)
[3]間充質干細胞抑制MEK/ERK信號通路改善盲腸結扎穿孔所致急性肺損傷中肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡[J]. 劉堅,呂海金,安玉玲,魏緒霞,易小猛,劉劍戎,熊亮,周密,易慧敏. 中山大學學報(醫(yī)學科學版). 2016(03)
[4]成骨誘導人臍帶間充質干細胞與納米羥基磷灰石/聚酰胺66支架材料的生物相容性[J]. 陳剛,廖前德,胡優(yōu)威,譚益云,鐘達. 中國組織工程研究. 2012(16)
本文編號：2938002
【文章來源】：中國醫(yī)藥導報. 2020年06期
【文章頁數】：6 頁
【部分圖文】：
Western blot檢測MEK/ERK通路及凋亡相關信號表達
MEK/ERK是Ras絲裂原信號轉導下游的核心元件，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，當細胞外刺激物（如LPS、細胞因子）與相應受體結合后，SOS與受體或受體底物上的酪氨酸（Tyr）磷酸化位點結合，在Ras附近形成高濃度的SOS，其促使GTP取代Ras上的GDP而活化Ras，使MEK催化區(qū)中Thr和Ser磷酸化激活MEK，發(fā)揮調控細胞凋亡的作用[16-17]。根據之前本課題組研究發(fā)現的膿毒癥所致ARDS中AECⅡ凋亡的機制與MEK/ERK磷酸化相關[8]，結合此次體外研究結果，即在LPS誘導A549凋亡模型中，p-MEK/p-ERK蛋白表達增高，本研究認為可能是LPS激活Ras/MEK/ERK信號通路，促進MEK和ERK磷酸化，進而導致細胞色素C的大量釋放，形成凋亡體后激活caspase 3，爆發(fā)級聯反應，最終導致AECⅡ凋亡[18-19]。MSC通過旁分泌各種生長因子，彌補損傷情況下生物多樣性重要成分，發(fā)揮調節(jié)如NF-κB、PI3K/AKT等重要信號通路的活性，從而改善凋亡的作用[9,20]。本研究結果發(fā)現，通過MSC-CM及PD98059與LPS誘導A549共培養(yǎng)，A549凋亡情況均改善，同時MSC與PD98059一致，其Bax/Bcl-2、Fas及MEK、MRK在基因水平與對照組存在明顯差異。且經MSC及PD98059干預后，Bax/bal-2的比例及caspase 3也較對照組明顯下調。結合MSC干預組的BAX和FAS在蛋白水平的表達上顯著低于對照組，且p-MEK和pERK的蛋白表達同樣弱于對照組，充分說明MSC極有可能是通過抑制MEK/ERK信號通路的磷酸化，從而抑制AECⅡ的凋亡，但其上游相關信號（Raf/Ras）如何調控MEK/ERK的活化尚需進一步的驗證。
Annexin-V-FITC/PI染色流式細胞術檢測各組細胞凋亡結果，如圖1所示，因隨著LPS濃度繼續(xù)增大，A549細胞以壞死為主[15]，故采用LPS(20μg/mL）建立誘導A549凋亡模型。2.2 hUC-MSC和PD98059干預后對LPS誘導的A549凋亡影響
【參考文獻】：
期刊論文
[1]參附注射液對膿毒癥小鼠免疫調節(jié)及炎癥因子的影響[J]. 趙鋒利,冼紹祥,羅苑苑,王澍欣,徐運升,林新峰. 中國醫(yī)藥導報. 2019(22)
[2]UC-MSC經PI3K/AKT信號通路影響人肺腺癌A549細胞的凋亡和增殖[J]. 袁哲,吳思夢,王亞君,王思亮,朱喜科. 中國腫瘤生物治療雜志. 2019(03)
[3]間充質干細胞抑制MEK/ERK信號通路改善盲腸結扎穿孔所致急性肺損傷中肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡[J]. 劉堅,呂海金,安玉玲,魏緒霞,易小猛,劉劍戎,熊亮,周密,易慧敏. 中山大學學報(醫(yī)學科學版). 2016(03)
[4]成骨誘導人臍帶間充質干細胞與納米羥基磷灰石/聚酰胺66支架材料的生物相容性[J]. 陳剛,廖前德,胡優(yōu)威,譚益云,鐘達. 中國組織工程研究. 2012(16)
本文編號：2938002
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