發(fā)布時(shí)間：2020-12-22 02:33

　　目的:為建立脊灰病毒Sabin株Ⅰ型特異的單克隆抗體.方法:以Vero細(xì)胞增殖病毒并用蔗糖密度梯度離心法純化后,用病毒免疫SPF級(jí)Balb/c小鼠.取小鼠免疫脾淋巴細(xì)胞與SP2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,通過(guò)間接ELISA法篩選抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞,并用有限稀釋法克隆化.用細(xì)胞培養(yǎng)法制備脊灰病毒單抗,并以中和試驗(yàn)測(cè)定單抗效價(jià).結(jié)果:獲得了8株分泌抗脊灰病毒Sabin株Ⅰ型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,其中1株G8G7能夠穩(wěn)定分泌抗體.間接ELISA法測(cè)得單抗的效價(jià)為1:8,中和試驗(yàn)測(cè)得中和抗體的效價(jià)為1:58.結(jié)論:G8G7分泌的抗體為抗脊灰病毒Sabin株Ⅰ型特異的單克隆抗體. 

【文章來(lái)源】：中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2018年04期

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

形態(tài);b)細(xì)胞完全病變形態(tài)圖1脊灰病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)a)正常細(xì)胞

胞完全CPE，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞收縮，由梭形逐漸變?yōu)閳A形，細(xì)胞間只有纖細(xì)的細(xì)胞間橋連接，細(xì)胞單層出現(xiàn)拉網(wǎng)結(jié)構(gòu)，融合成片(見(jiàn)圖1b)．a(chǎn))正常細(xì)胞形態(tài);b)細(xì)胞完全病變形態(tài)圖1脊灰病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)Fig．1CPEofpoliovirus2．2效價(jià)測(cè)定將收獲的病毒原液經(jīng)過(guò)PEG濃縮后，測(cè)定每個(gè)批次病毒效價(jià)．第1～6d，I型脊灰病毒原液的效價(jià)和濃縮毒液的效價(jià)存在顯著差異．終點(diǎn)效價(jià)，其中I型10倍和500倍濃縮毒液的效價(jià)均顯著高于原液的效價(jià)(P＜0．05，見(jiàn)圖2)．與I型原液相比，*P＜0．05，＊＊P＜0．01，n=3圖2脊灰病毒I型效價(jià)測(cè)定Fig．2TiterdeterminationofpoliovirustypeI2．3脊灰病毒Sabin株I型VP1基因的擴(kuò)增針對(duì)I型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的編碼區(qū)設(shè)計(jì)的引物UG1和UC11，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCＲ擴(kuò)增后，產(chǎn)生約1100bp的特異性產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在1100第4期王朝元，等:脊髓灰質(zhì)炎病毒I型單克隆抗體的制備73

bp處各有一條明亮的脊灰病毒VP1基因的特異性條帶，460bp處為試劑盒陽(yáng)性對(duì)照條帶，1100bp處為目的條帶(見(jiàn)圖3)，其表明逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增成功，初步確定病毒為脊髓灰質(zhì)炎病毒．M)DNA標(biāo)準(zhǔn)品;PC)陽(yáng)性對(duì)照;1，2，3)I型脊灰病毒樣品圖3脊灰病毒Sabin株I型VP1基因ＲT-PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物Fig．3ＲT-PCＲamplificationproductofVP1genefrompoliovirusSabintypeI2．4病毒純化蛋白含量及SDS-PAGE圖譜經(jīng)過(guò)蔗糖(質(zhì)量比為15%～50%)密度梯度離心，及50%，30%蔗糖墊層離心后，培養(yǎng)的脊灰病毒純化效果一般，其蛋白含量為2．764mg/mL．脊灰病毒的3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1，VP2，VP3在SDS-PAGE圖譜上可見(jiàn)分子量分別為35，28，24KDa．M)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品;1)純化病毒的衣殼蛋白圖4純化脊灰病毒衣殼蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig．4SDS-PAGEresultofVPsfrompurifiedpoliovirus2．5細(xì)胞融合及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞建株細(xì)胞融合后，第3d出現(xiàn)幾個(gè)渾圓透亮正在生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞;第5～6d出現(xiàn)多個(gè)成葡萄串狀分布的融合細(xì)胞集落;生長(zhǎng)至第8d時(shí)，融合細(xì)胞集落繼續(xù)長(zhǎng)大，有肉眼可見(jiàn)針尖樣大小的集落;約第12d，細(xì)胞集落可布滿每孔1/3～1/2的面積，培養(yǎng)液顏色呈黃色，此時(shí)可進(jìn)行抗體篩選(見(jiàn)圖5)．共進(jìn)行6次細(xì)胞融合，鋪29塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，6次的細(xì)胞融合率分別為15．63%，3．12%，66．49%，33．33%，46．65%，14．21%;篩選到8株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)3次有限稀釋克隆化后，得到1株穩(wěn)定分泌脊灰病毒I型抗體的雜交瘤細(xì)胞株G8G7．a(chǎn))3d;b)5d;c)8d;d)12d

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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