本文關(guān)鍵詞：folP1與folP2基因在磺胺甲惡唑—甲氧芐啶抗分枝桿菌中的作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobactrium tuberculosis,Mtb)引起的慢性傳染病。耐藥TB的出現(xiàn)使得TB成為嚴重的公共衛(wèi)生問題和社會問題,現(xiàn)有的抗TB藥物已經(jīng)不能滿足需要,新藥的研發(fā)顯得更為迫切。然而新藥的研發(fā)又需要耗費大量的時間與金錢,如果能利用已經(jīng)應(yīng)用于臨床的藥物來治療TB,將使得TB藥物的研發(fā)更加快速、便宜�；前芳讗哼�(Sulfamethoxazole, SMX)在體內(nèi)和體外均具有抗TB作用,是治療耐藥TB的候選藥物之一。在臨床上SMX與甲氧芐啶(trimethoprim, TMP)聯(lián)合用于治療細菌引起的呼吸道、泌尿道和胃腸道感染。研究發(fā)現(xiàn)SMX與TMP主要作用機制分別是靶向葉酸合成途徑中的二氫蝶酸合酶(dihydropteroic acid synthase,DHPS)和二氫葉酸還原酶(dihydrofolic acid, DHFR);但是SMX與TMP在分枝桿菌中的作用機制至今還未被闡明。 本研究旨在探究分枝桿菌中folP1與folP2基因在TMP-SMX抗分枝桿菌中的作用,從而加速以TMP-SMX為基礎(chǔ)的抗TB新藥的研發(fā)。在分枝桿菌中,folP1基因編碼DHPS,而folP2基因編碼的蛋白與其具有同源性。本研究通過在恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis, Msm)中分別過表達Mtb和Msm的folP1/2基因及敲除Msm folP2基因,得到重組菌株Msm::p60fp1, Msm::p60fp2, Msm::p60Msfp1, Msm::p60Msfp2和Msm△folP2,再通過固體平板法檢測SMX和TMP對這些重組菌株的的最小抑制濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Msm中過表達MtbfolPl基因會使SMX和TMP的MIC都增加4倍；在Msm中過表達Msm folP1基因會使SMX和TMP的MIC都增加2倍。另外,敲除Msm的folP2基因后,SMX對其的MIC降低至野生型Msm的1/8,這可能是由于folP2基因產(chǎn)物的存在減弱了SMX的抑菌效果,暗示了FolP2抑制劑與SMX聯(lián)用時可能會有較好的抗TB效果。 在本研究中我們也在嘗試改進分枝桿菌基因敲除技術(shù)。由于Mtb生長緩慢,需要在P3實驗室操作等原因,許多已存在的高效率的基因敲除技術(shù)都不能應(yīng)用于Mtb。在過去20年,雖然出現(xiàn)了大量的分枝桿菌基因敲除技術(shù),但這些技術(shù),要么需要通過電轉(zhuǎn)化將DNA轉(zhuǎn)入分枝桿菌體內(nèi),要么需要利用噬菌體作為載體將同源的DNA遞送到Mtb菌內(nèi),然后通過同源重組達到基因敲除的目的。分枝桿菌電轉(zhuǎn)化效率低,再加上同源重組的低效率極大地限制了相關(guān)技術(shù)在分枝桿菌中的應(yīng)用,尤其是慢速分枝桿菌。即便是最近引入了重組工程的方法來增強重組效率,利用電轉(zhuǎn)化獲得基因敲除株的效率仍然很低；然而構(gòu)建噬菌體的方法,需要體外包裝的步驟,不僅制備昂貴而且受到DNA包裝大小的更嚴格的限制。本研究通過改進的方法將等位交換底物(allelic exchange substrates, AESs)插入分枝桿菌phAE159噬菌體基因組中構(gòu)建重組噬菌體,進一步通過噬菌體可高效地將AESs引入分枝桿菌中,從而提高基因敲除效率。
【關(guān)鍵詞】：分枝桿菌 folP1 folP2 磺胺甲惡唑 甲氧芐啶 基因敲除 噬菌體
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-26
• 1.1 結(jié)核病概述12-16
• 1.1.1 結(jié)核病12
• 1.1.2 Mtb的生物學(xué)特性12-13
• 1.1.3 Mtb的致病機制13-14
• 1.1.4 TB的治療14-15
• 1.1.5 耐藥TB的出現(xiàn)15
• 1.1.6 抗TB藥物研發(fā)15-16
• 1.2 磺胺甲惡唑-甲氧芐啶16-19
• 1.2.1 磺胺甲惡唑-甲氧芐啶的應(yīng)用16-17
• 1.2.2 TMP-SMX作用機制17
• 1.2.3 TMP-SMX與TB17-19
• 1.3 葉酸合成途徑19-21
• 1.3.1 葉酸合成途徑的重要性19
• 1.3.2 葉酸合成途徑中的DHPS19-20
• 1.3.3 分枝桿菌中的folP1與folP2基因20-21
• 1.4 研究基礎(chǔ)21-23
• 1.5 研究意義與方法23
• 1.6 基因敲除技術(shù)的研究23-26
• 第二章 實驗材料與方法26-48
• 2.1 實驗材料26-31
• 2.1.1 實驗菌株與質(zhì)粒26-27
• 2.1.2 實驗所用引物27-28
• 2.1.3 主要試劑和耗材28
• 2.1.4 抗生素與藥物28-29
• 2.1.5 常用培養(yǎng)基與相關(guān)溶液29-30
• 2.1.6 實驗儀器30-31
• 2.2 實驗方法31-48
• 2.2.1 過表達folP1與folP2基因質(zhì)粒的構(gòu)建31-36
• 2.2.2 同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建36-37
• 2.2.3 重組分枝桿菌的構(gòu)建37-39
• 2.2.4 folP2基因敲除株的鑒定39-43
• 2.2.5 重組分枝桿菌藥物敏感性檢測43
• 2.2.6 重組分枝桿菌生長曲線的測定43-44
• 2.2.7 互補實驗44
• 2.2.8 耐藥菌株的篩選44
• 2.2.9 基因敲除技術(shù)的改進與探究44-48
• 第三章 結(jié)果與討論48-60
• 3.1 Mtb藥物敏感性檢測48
• 3.2 質(zhì)粒的構(gòu)建48-50
• 3.2.1 過表達folP1與folP2基因質(zhì)粒的構(gòu)建48-50
• 3.2.2 同源重組質(zhì)粒pblMsfp2LRH的構(gòu)建50
• 3.3 重組分枝桿菌的構(gòu)建50-53
• 3.3.1 過表達folP1與folP2基因分枝桿菌的構(gòu)建50-51
• 3.3.2 Msm folP2基因敲除株的構(gòu)建51
• 3.3.3 folP2基因敲除株的鑒定51-53
• 3.4 藥物敏感性檢測53-54
• 3.5 重組分枝桿菌生長曲線的測定54-55
• 3.6 互補實驗與耐藥菌株的篩選55
• 3.7 基因敲除技術(shù)的改進與探究55-57
• 3.7.1 p159LART質(zhì)粒的構(gòu)建55
• 3.7.2 質(zhì)粒pblfp2LRH的構(gòu)建55-56
• 3.7.3 質(zhì)粒pblMsfp2LRHA159與pblfp2LRHA159的構(gòu)建56-57
• 3.7.4 噬粒p159Msfp2LRH與p159fp2LRH的鑒定57
• 3.7.5 噬菌體制備57
• 3.8 討論57-60
• 參考文獻60-70
• 致謝70-71
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的其他研究成果71

【共引文獻】

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本文編號：292786