目的通過建立毛囊蠕形螨與HaCaT細胞共培養(yǎng)體系,探討毛囊蠕形螨與細胞表達TLR2以及炎癥相關基因之間的關聯(lián)性。方法用10只、30只、50只毛囊蠕形螨和空白對照分別與HaCaT細胞共培養(yǎng)24 h,提取細胞RNA,反轉錄成cDNA;設計特異性引物,對TLR2以及相關的KLK5、IL-1β、IL-6、IL-8和CCL2等炎性因子進行常規(guī)PCR擴增、克隆和測序;采用qRT-PCR檢測表達量,比較與螨蟲數(shù)之間的關聯(lián)性。結果瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物為單一清晰條帶,序列大小與模板一致,表明引物特異性好。qRT-PCR檢測顯示,除10只螨蟲組與空白組差異均無統(tǒng)計學意義外(t=0. 00～2. 25,P0. 05),TLR2和IL-6在30只和50只螨蟲組與空白組差異有統(tǒng)計學意義(TLR2:t=6. 54和10. 85; IL-6:t=14. 35和17. 52,P0. 001),且50只螨蟲組上調明顯大于30只螨蟲組; IL-8、CCL2和KLK5在30只和50只螨蟲組與空白組的差異也有統(tǒng)計學意義(IL-8:t=5. 34和6. 98; CCL2:t=3. 12和4. 03; KLK5:t=3. 31和4. 05,P0. 05),但30只與50只螨蟲組的差異無統(tǒng)計學意義;而IL-1β只在50只螨蟲組與空白組的差異有統(tǒng)計學意義(t=2. 60,P0. 05),30只螨蟲組與空白組的差異無統(tǒng)計學意義。HaCaT細胞TLR2的表達與蠕形螨蟲數(shù)呈正相關(r=0. 984),與TLR2調控的炎性因子IL-6、IL-8、CCL2、KLK5和IL-1β的表達也呈正相關(r=0. 970、0. 984、0. 985、0. 974和0. 938),尤其是TLR2和IL-6表達量變化最明顯。結論本研究成功構建了毛囊蠕形螨與HaCaT細胞共培養(yǎng)體系,首次從細胞水平揭示皮膚免疫反應與蠕形螨感染數(shù)量有關,這一探索性研究結果對于揭示蠕形螨寄生誘發(fā)面部皮膚損害的分子機制具有重要的科學意義。
【部分圖文】：

圖4顯示，目的基因qRT-PCR擴增曲線平整呈“S型”，復孔重復性好，陰性對照無擴增，表明加樣準確且無污染;熔解曲線顯示各基因解鏈溫度在83～89℃之間，均為單峰，不存在引物二聚體或非特異性擴增，說明產(chǎn)物特異性好，定量結果準確。圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖1 共培養(yǎng)前的Ha Ca T細胞形態(tài)(A)與共培養(yǎng)24 h后的螨蟲形態(tài)(B)qRT-PCR結果顯示(圖5、圖6和表2)，雖然六個目的基因的相對mRNA表達量在10只螨蟲組與空白組差異無統(tǒng)計學意義，但TLR2和KLK5表達量與蟲數(shù)呈正相關，相關性有統(tǒng)計學意義(r=0.984和0.974,P<0.05)。30只螨蟲組TLR2表達量明顯高于10只螨蟲組和空白組(t=6.35和6.54,P<0.001);50只螨蟲組高于30只螨蟲組(t=4.31,P=0.003)。30只螨蟲組KLK5只高于空白組(t=3.31,P=0.011)，不高于10只組;但50只螨蟲組高于10只螨蟲組(t=2.79,P=0.024)。

炎癥相關因子IL-6、IL-8和CCL2表達量與蟲數(shù)也呈明顯正相關(r=0.970、0.984和0.985,P<0.05),IL-1β相關性不顯著(r=0.938,P>0.05)。在IL-6，表達量隨蟲數(shù)變化上調最明顯，50只螨蟲組、30只螨蟲組和10只螨蟲組兩兩之間的差異均有統(tǒng)計學意義。在IL-8,50只螨蟲組和30只螨蟲組均明顯高于10只螨蟲組和空白組，但50只組和30只組之間的差異無統(tǒng)計學意義(t=1.64,P=0.139)。在CCL2,50只螨蟲組與10只螨蟲組和空白組的差異有統(tǒng)計學意義(t=3.09,P=0.015;t=4.03,P=0.04),30只螨蟲組與空白組差異也有統(tǒng)計學意義(t=3.12,P=0.014)，但其他各組兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義。在IL-1β，隨蟲數(shù)增加表達量變化更小，只有50只螨蟲組與空白組差異有統(tǒng)計學意義(t=2.60,P=0.032)。圖4 qRT-PCR擴增曲線(A-C,G-I)和熔解曲線(D-F,J-L)
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