目的通過(guò)建立毛囊蠕形螨與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)體系,探討毛囊蠕形螨與細(xì)胞表達(dá)TLR2以及炎癥相關(guān)基因之間的關(guān)聯(lián)性。方法用10只、30只、50只毛囊蠕形螨和空白對(duì)照分別與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)24 h,提取細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA;設(shè)計(jì)特異性引物,對(duì)TLR2以及相關(guān)的KLK5、IL-1β、IL-6、IL-8和CCL2等炎性因子進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序;采用qRT-PCR檢測(cè)表達(dá)量,比較與螨蟲(chóng)數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物為單一清晰條帶,序列大小與模板一致,表明引物特異性好。qRT-PCR檢測(cè)顯示,除10只螨蟲(chóng)組與空白組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(t=0. 00～2. 25,P0. 05),TLR2和IL-6在30只和50只螨蟲(chóng)組與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TLR2:t=6. 54和10. 85; IL-6:t=14. 35和17. 52,P0. 001),且50只螨蟲(chóng)組上調(diào)明顯大于30只螨蟲(chóng)組; IL-8、CCL2和KLK5在30只和50只螨蟲(chóng)組與空白組的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-8:t=5. 34和6. 98; CCL2:t=3. 12和4. 03; KLK5:t=3. 31和4. 05,P0. 05),但30只與50只螨蟲(chóng)組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而IL-1β只在50只螨蟲(chóng)組與空白組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2. 60,P0. 05),30只螨蟲(chóng)組與空白組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HaCaT細(xì)胞TLR2的表達(dá)與蠕形螨蟲(chóng)數(shù)呈正相關(guān)(r=0. 984),與TLR2調(diào)控的炎性因子IL-6、IL-8、CCL2、KLK5和IL-1β的表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0. 970、0. 984、0. 985、0. 974和0. 938),尤其是TLR2和IL-6表達(dá)量變化最明顯。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了毛囊蠕形螨與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)體系,首次從細(xì)胞水平揭示皮膚免疫反應(yīng)與蠕形螨感染數(shù)量有關(guān),這一探索性研究結(jié)果對(duì)于揭示蠕形螨寄生誘發(fā)面部皮膚損害的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。
【部分圖文】：

圖4顯示，目的基因qRT-PCR擴(kuò)增曲線平整呈“S型”，復(fù)孔重復(fù)性好，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，表明加樣準(zhǔn)確且無(wú)污染;熔解曲線顯示各基因解鏈溫度在83～89℃之間，均為單峰，不存在引物二聚體或非特異性擴(kuò)增，說(shuō)明產(chǎn)物特異性好，定量結(jié)果準(zhǔn)確。圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖1 共培養(yǎng)前的Ha Ca T細(xì)胞形態(tài)(A)與共培養(yǎng)24 h后的螨蟲(chóng)形態(tài)(B)qRT-PCR結(jié)果顯示(圖5、圖6和表2)，雖然六個(gè)目的基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量在10只螨蟲(chóng)組與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TLR2和KLK5表達(dá)量與蟲(chóng)數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.984和0.974,P<0.05)。30只螨蟲(chóng)組TLR2表達(dá)量明顯高于10只螨蟲(chóng)組和空白組(t=6.35和6.54,P<0.001);50只螨蟲(chóng)組高于30只螨蟲(chóng)組(t=4.31,P=0.003)。30只螨蟲(chóng)組KLK5只高于空白組(t=3.31,P=0.011)，不高于10只組;但50只螨蟲(chóng)組高于10只螨蟲(chóng)組(t=2.79,P=0.024)。

炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-8和CCL2表達(dá)量與蟲(chóng)數(shù)也呈明顯正相關(guān)(r=0.970、0.984和0.985,P<0.05),IL-1β相關(guān)性不顯著(r=0.938,P>0.05)。在IL-6，表達(dá)量隨蟲(chóng)數(shù)變化上調(diào)最明顯，50只螨蟲(chóng)組、30只螨蟲(chóng)組和10只螨蟲(chóng)組兩兩之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在IL-8,50只螨蟲(chóng)組和30只螨蟲(chóng)組均明顯高于10只螨蟲(chóng)組和空白組，但50只組和30只組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.64,P=0.139)。在CCL2,50只螨蟲(chóng)組與10只螨蟲(chóng)組和空白組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.09,P=0.015;t=4.03,P=0.04),30只螨蟲(chóng)組與空白組差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.12,P=0.014)，但其他各組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在IL-1β，隨蟲(chóng)數(shù)增加表達(dá)量變化更小，只有50只螨蟲(chóng)組與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.60,P=0.032)。圖4 qRT-PCR擴(kuò)增曲線(A-C,G-I)和熔解曲線(D-F,J-L)
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