發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 11:55

　　 背景了解細(xì)菌蛋白對(duì)免疫細(xì)胞的作用效應(yīng)是評(píng)價(jià)其是否能用于抵抗細(xì)菌感染的重要依據(jù)。PepO是一種細(xì)菌中保守存在的肽鏈內(nèi)切酶類蛋白,其缺陷菌株粘附和侵襲能力較野生菌株明顯減弱,是肺炎鏈球菌中一個(gè)新毒力因子。我們的研究顯示PepO有強(qiáng)烈的肺部致炎作用,但其導(dǎo)致的免疫效應(yīng)和具體機(jī)制尚不清楚。肺泡巨噬細(xì)胞在宿主防御呼吸道細(xì)菌感染中發(fā)揮著重要作用,肺部對(duì)肺炎鏈球菌的清除始于巨噬細(xì)胞,因此本研究擬以巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,探究PepO對(duì)巨噬細(xì)胞的作用效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。方法經(jīng)典吞噬實(shí)驗(yàn)觀察PepO刺激腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞后其吞噬能力的改變;Q-PCR檢測(cè)PepO誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的miR-155、SHIP1 mRNA的表達(dá)變化;Western blot檢測(cè)PepO誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的SHIP1、AKT、NF-k B蛋白表達(dá)變化;轉(zhuǎn)染miR-155的mimic或inhibitor,以過(guò)表達(dá)或降低該基因的胞內(nèi)水平,檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬能力改變和SHIP1mRNA表達(dá)水平的變化;采用信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合PepO處理巨噬細(xì)胞,Q-PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá);采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-155靶向SHIP1的熒光素酶活性;采用免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬能力改變,表面受體CR3表達(dá)情況,及NF-kB核轉(zhuǎn)位的變化。結(jié)果PepO處理巨噬細(xì)胞后,細(xì)胞對(duì)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌的吞噬能力增強(qiáng),呈劑量和時(shí)間依賴性。Q-PCR結(jié)果顯示,PepO刺激巨噬細(xì)胞后,其miRNA-155的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高,呈劑量和時(shí)間依賴性。轉(zhuǎn)染miRNA-155抑制劑的巨噬細(xì)胞,PepO處理后其吞噬細(xì)菌的能力較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的巨噬細(xì)胞顯著下調(diào),而轉(zhuǎn)染miRNA-155的mimic巨噬細(xì)胞的吞噬細(xì)菌能力較相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞顯著上升,提示PepO可通過(guò)誘導(dǎo)miRNA-155的表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。熒光素酶報(bào)告SHIP1基因檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA-155的細(xì)胞其熒光素酶活性較對(duì)照細(xì)胞顯著升高,證明miRNA-155的確能靶向調(diào)控SHIP1基因表達(dá)。Q-PCR和Western bloting結(jié)果顯示,PepO誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞的SHIP1表達(dá)顯著下調(diào),且呈劑量和時(shí)間依賴性。而轉(zhuǎn)染miRNA-155抑制劑的巨噬細(xì)胞,PepO處理后其SHIP1的mRNA表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的巨噬細(xì)胞顯著下調(diào),轉(zhuǎn)染miRNA-155 mimic的巨噬細(xì)胞,PepO處理后其SHIP1的mRNA表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的巨噬細(xì)胞顯著上調(diào),這些結(jié)果提示PepO可通過(guò)miRNA-155調(diào)控SHIP1的表達(dá)。CR3為巨噬細(xì)胞識(shí)別細(xì)菌的受體之一,有文獻(xiàn)提示其表達(dá)受SHIP1的負(fù)調(diào)控,我們的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,PepO處理巨噬細(xì)胞后其CR3較陰性對(duì)照組顯著升高。這些結(jié)果提示PepO可能通過(guò)誘導(dǎo)miRNA-155下調(diào)SHIP1表達(dá),從而促進(jìn)CR3表達(dá)增加而提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力。將PepO分別處理TLR2缺陷小鼠來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞和野生鼠的巨噬細(xì)胞,結(jié)果顯示TLR2缺陷鼠的巨噬細(xì)胞表達(dá)miRNA-155較野生鼠顯著降低,其SHIP1的表達(dá)水平不隨PepO刺激的時(shí)間延長(zhǎng)而降低,同時(shí)其CR3的表達(dá)水平也不像野生鼠的巨噬細(xì)胞,因PepO的刺激而顯著增高。抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Akt和NF-κB的抑制劑處理細(xì)胞后,PepO刺激的miRNA-155表達(dá)較未處理組顯著下調(diào)。PepO刺激后巨噬細(xì)胞的Akt磷酸化水平顯著增高,NF-κB的含量及入核量顯著增加,而TLR2缺陷鼠的巨噬細(xì)胞在受到PepO刺激后,仍存在Akt磷酸化水平增高,但NF-κB的含量及入核量無(wú)顯著改變,這些結(jié)果提示PepO主要依賴于TLR2-NF-κB通路誘導(dǎo)miRNA-155的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論P(yáng)epO可通過(guò)TLR2-NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)miRNA-155表達(dá)增高,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力,該作用還可能與SHIP1表達(dá)的下調(diào)以及CR3表達(dá)上調(diào)相關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R378.1
【文章目錄】：
英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照
中文摘要
英文摘要
前言
1 實(shí)驗(yàn)材料
2 實(shí)驗(yàn)方法
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
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