通過半胱氨酸(Cys)上的1,2-氨基硫醇和氰基苯并噻唑(CBT)之間的點擊縮合反應(CBT-Cys)或酶控自組裝(EISA)等原理制備的超分子納米材料己經(jīng)成功地被用于分子影像(光學和磁共振等)、材料化學(制備納米粒子和水凝膠等)以及對蛋白質(zhì)的修飾等領域。雖然目前已經(jīng)有不少研究者正致力于利用納米材料對機體免疫系統(tǒng)進行調(diào)控進而對腫瘤或感染性疾病等免疫相關疾病進行干預,但通過使用CBT-Cys點擊縮合反應或EISA原理設計的超分子納米材料有目的地對免疫系統(tǒng)施加影響以干預疾病進程或者對這些材料可能在體內(nèi)造成的與免疫系統(tǒng)相關的效應的研究則仍有待深入。基于肽鏈序列本身具備的天然屬性所產(chǎn)生的高度生物兼容性,我們可以設計出多種功能小分子前體并通過CBT-Cys點擊縮合反應或EISA原理使其以不同的途徑或者在不同的部位發(fā)生自組裝或解組裝等過程以實現(xiàn)藥物緩釋或信號放大等目的。通過上述原理,我們在得到不同納米結(jié)構(gòu)(如納米纖維或納米粒子)的同時,也希望所設計的化合物能夠在免疫相關疾病(如腫瘤、感染性疾病和自身免疫病等)的發(fā)生發(fā)展過程中實現(xiàn)增強藥效、降低藥物毒副作用或?qū)崟r追蹤相關生物學指標等目的。因此,基于目前依然存在于超分子化學和免疫學之間的大量研究空白,針對利用CBT-Cys點擊縮合反應或EISA原理所制備的超分子納米材料在免疫學中可能效應的深入研究具有廣泛的應用前景和重要的科學價值�；诖�,在本文中,我們合理地設計了不同的超分子化合物前體并通過以上兩種超分子自組裝原理實現(xiàn)了針對不同免疫學情境的功能應用:(1)高濃度紫杉醇(PTX)通常被用來作為一種化學療法藥物對抗腫瘤,但同時會對機體特別是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重的毒副作用并反過來使得機體自身的免疫力被嚴重削弱。而當使用低濃度PTX時,研究發(fā)現(xiàn)該藥物能夠有效刺激免疫細胞的抗腫瘤潛能。因此,在高濃度下使用PTX并降低其對免疫系統(tǒng)的毒性而又能夠保持其對免疫細胞的抗腫瘤潛力的刺激能力則仍然極具挑戰(zhàn)性。本文中,我們合理地設計了一種 PTX 的衍生物(Cys(StBu)-Arg-Arg-Arg-Lys(PTX)-CBT(1))用以十分簡便地制備包載PTX的納米粒子(1-NP)。體外實驗證實,在高PTX濃度下,1-NP較游離PTX表現(xiàn)出了更低的對于巨噬細胞的細胞毒性,同時其可以被巨噬細胞有效吞噬并隨后以一種劑量依賴的方式使細胞極化為一種具備抗腫瘤活性的狀態(tài)。體內(nèi)實驗進一步證明1-NP較游離PTX具有更強的抗腫瘤效應但同時其對存在于免疫器官以及腫瘤部位的免疫細胞的細胞毒性則明顯更弱。我們的結(jié)果說明,通過使用不同劑量的1-NP,能夠精確地對病人免疫系統(tǒng)的活化進行調(diào)控以獲得更有效的抗腫瘤效果和可控的自身免疫應答。我們也需指出該治療策略可作為一項結(jié)合免疫療法和化學療法二者優(yōu)勢的有效嘗試并有望在將來達到更好的抗腫瘤臨床療效;(2)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是在多種免疫相關疾病(如肝臟纖維化和腫瘤)中起到關鍵作用的一種蛋白酶家族。而截至目前,利用酶控近紅外(NIR)熒光納米粒子解組裝促使熒光恢復對MMPs在疾病進程中的活性進行檢測或成像的研究仍鮮有報道。本文中,我們合理地設計了一種新的熒光信號可以通過還原控制的縮合以及隨后的納米粒子(1-NP)自組裝而發(fā)生自猝滅的NIR探針1。而通過基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的酶切,1-NP會被解組裝而使NIR熒光得到恢復。利用這個過程,我們成功地在體外和活細胞中分別將1-NP運用于對MMP-2活性的NIR檢測和成像。另外,我們也利用1-NP對裸鼠中的MC38結(jié)腸癌模型腫瘤中的MMP-2活性進行了特異性NIR成像。我們需要指出該NIR探針1可能在將來被進一步發(fā)展成在臨床前研究甚至是臨床研究中的腫瘤靶向成像工具;(3)地塞米松(Dex)是一種重要的抗炎藥物但是高劑量使用Dex會引發(fā)嚴重的毒副作用。因此發(fā)明新的策略來促進Dex的抗炎效果便顯得尤為重要但仍存在困難。本文中,我們利用一種酶控自組裝系統(tǒng)發(fā)明了一種細胞內(nèi)共組裝的策略來增強Dex的抗炎能力。在堿性磷酸酶(ALP)的催化作用下,凝膠因子前體Nap-Phe-Phe-Tyr(H2PO3)-OH(1p)自組裝成水凝膠Gel 1但地塞米松磷酸鹽(Dp)則僅僅轉(zhuǎn)變成Dex的沉淀。然而,將等量1p和Dp通過ALP誘導而發(fā)生共組裝則形成了一種新的水凝膠Gel 2。兩種炎癥細胞模型實驗說明細胞內(nèi)的ALP誘發(fā)的Dp和1p的共組裝極大地促進了 Dex的抗炎效力。我們指出我們的細胞內(nèi)共組裝策略或可以被廣泛用于促進更多藥物的治療效果,而同時也可以被用來緩解這些藥物的毒副作用;(4)肝臟纖維化可由多種慢性肝臟疾病引發(fā),如果不對其進程進行及時有效干預,則會進一步發(fā)展為肝硬化甚至是肝細胞癌�？寡庄煼ɑ蚩梢宰鳛橐环N標準的治療肝臟纖維化的策略,但智能的、肝臟纖維化靶向的同時又能使抗炎藥物(Dex)發(fā)生自組裝和緩慢釋放的抗肝纖維化療法則仍然未見報道。本文中,我們合理地設計了一種凝膠因子前體Nap-Phe-Phe-Lys(Dex)-Tyr(H2PO3)-OH(1-Dex-P)并且提出了一種串聯(lián)酶控自組裝以及藥物緩釋策略使得Dex的抗肝臟纖維化效應較游離Dex在體外以及體內(nèi)均明顯提升。酶切實驗證實1-Dex-P首先會被ALP脫磷酸化而轉(zhuǎn)變成Nap-Phe-Phe-Lys(Dex)-Tyr-OH(1-Dex)并自組裝成納米纖維1-Dex,而該納米纖維接著會被酯酶水解緩慢釋放出Dex而轉(zhuǎn)變成另一種納米纖維1。我們設想該串聯(lián)酶控策略可以在將來被廣泛用于設計更多精致的藥物輸送體系從而增強藥物的療效。
【學位單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 CBT-Cys點擊縮合反應簡介
        1.1.1 CBT-Cys點擊反應用于蛋白標記
        1.1.2 CBT-Cys點擊反應用于分子影像
        1.1.3 CBT-Cys點擊反應用于納米結(jié)構(gòu)自組裝
        1.1.4 CBT-Cys點擊反應用于癌癥治療
    1.2 超分子生物功能材料簡介
    1.3 免疫系統(tǒng)和免疫學簡介
    1.4 超分子自組裝納米材料在免疫學上的應用
    1.5 總結(jié)和展望
    1.6 論文的選題及主要工作
    參考文獻
第二章 紫杉醇超分子自組裝納米粒子激活免疫系統(tǒng)抵抗癌癥
    2.1 引言
    2.2 實驗方法
        2.2.1 試劑及儀器型號
        2.2.2 小鼠
        2.2.3 骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）培養(yǎng)
        2.2.4 共孵育實驗
        2.2.5 黑色素瘤腫瘤模型建立
        2.2.6 流式細胞術
        2.2.7 熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）
        2.2.8 細胞計數(shù)微球陣列實驗（CBA）
        2.2.9 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測
        2.2.10 1以及1-NP的合成及表征
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 化合物1的合成與表征以及1-NP的體外自組裝
        2.3.2 高PTX濃度下1-NP對免疫細胞顯示弱細胞毒性
        2.3.3 1-NP在體外能夠刺激巨噬細胞表面過表達CD11b
        2.3.4 1-NP使巨噬細胞產(chǎn)生M1型極化而同時能夠抑制其M2型極化
        2.3.5 1-NP以一種劑量依賴的方式刺激巨噬細胞極化
        2.3.6 1-NP較PTX具有更強的抗黑色素瘤效應,且該效應與其對免疫系統(tǒng)的刺激相關
        2.3.7 1-NP能夠降低PTX在免疫器官和腫瘤部位對免疫細胞的細胞毒性,并且對治療小鼠未表現(xiàn)出明顯毒副作用
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
    參考文獻
第三章 自猝滅近紅外熒光納米粒子解組裝實現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶有效檢測
    3.1 引言
    3.2 實驗方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 主要的實驗方法
        3.2.3 化合物的合成及表征
        3.2.4 MTT實驗
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 設計思路
        3.3.2 利用1-NP對MMP-2活性進行體外NIR熒光檢測
        3.3.3 在細胞中對MMP-2樣活性進行NIR成像
        3.3.4 在荷瘤小鼠體內(nèi)實現(xiàn)針對MMP-2酶樣活性的NIR成像
    3.4 本章小結(jié)
    參考文獻
第四章 細胞內(nèi)共組裝有效促進地塞米松的抗炎能力
    4.1 引言
    4.2 實驗方法
        4.2.1 常規(guī)方法和材料
        4.2.2 水凝膠制備的常規(guī)程序
        4.2.3 骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）培養(yǎng)
        4.2.4 共孵育實驗
        4.2.5 流式細胞術
        4.2.6 MTT實驗
        4.2.7 化合物的合成及表征
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 1p和Dp能夠通過酶控共組裝形成新的水凝膠
        4.3.2 1p和Dp通過酶控共組裝形成的水凝膠具有更強機械性能
        4.3.3 1p和Dp的酶控共組裝能夠明顯提升Dex在細胞水平的抗炎能力
    4.4 小結(jié)與展望
    參考文獻
第五章 串聯(lián)酶控自組裝和藥物緩釋增強地塞米松抗肝臟纖維化效應
    5.1 引言
    5.2 實驗方法
        5.2.1 實驗試劑和儀器
        5.2.2 水凝膠制備的常規(guī)方法
        5.2.3 骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的培養(yǎng)
        5.2.4 細胞孵育實驗
        5.2.5 流式細胞術
        5.2.6 MTT實驗
        5.2.7 肝臟纖維化模型建立
        5.2.8 蘇木精尹紅（H&E）染色及天狼星紅染色
        5.2.9 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測
        5.2.10 熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）
        5.2.11 數(shù)據(jù)分析
        5.2.12 化合物的合成及表征
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 1-Dex-P能夠在ALP和酯酶作用下發(fā)生串聯(lián)自組裝和藥物緩釋
        5.3.2 1-Dex-P的串聯(lián)酶控自組裝和藥物緩釋能夠提升Dex抗細胞炎癥的能力
        5.3.3 1-Dex-P的串聯(lián)酶控自組裝和藥物緩釋能夠提升Dex的抗肝臟纖維化能力
    5.4 小結(jié)與展望
    參考文獻
致謝
在讀期間發(fā)表的學術論文與取得的研究成果

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本文編號：2880065