腸道病毒71型（Enterovirus，EV71）包含單股正鏈RNA基因組，屬于小RNA病毒科（picornavirus family）腸道病毒屬成員,其感染嬰幼兒后能引起手足口�。╤and-foot-mouth disease，HFMD）。EV71基因組長約7.5Kb (kilobase, Kb)，僅由一個開放閱讀框構(gòu)成，編碼一個多聚蛋白前體,這個多聚蛋白前體能裂解成四個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4），七個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C和3A、3B、3C和3D）。雖然有研究表明IFN-I（type I interferon，IFN-I）能保護細胞抵抗EV71的感染，然而EV71并不誘導IFN-I的產(chǎn)生。最近研究發(fā)現(xiàn)EV71能夠通過阻斷RIG-I、干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulated factor7，IRF7）以及I型干擾素受體（IFN-I receptor， IFNAR）的表達來抑制干擾素誘導基因（Interferon-stimulated gene, ISG）的激活。 宿主通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）和病原微生物的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）的相互作用來識別病毒和入侵微生物。PRR包括了膜受體和胞質(zhì)受體。膜受體為Toll樣受體（Toll-like receptors, TLRs），而胞質(zhì)受體包括NOD樣受體（NOD-like receptor，NLRs）以及RLR樣受體（（RIG-I-like receptor，RLRs）。RLR樣受體包括RIG-I（retinoid acid-inducible gene I, RIG-I）和MDA-5(melanomadifferentiation-associated gene5, MDA-5)。RIG-I和MDA-5都包含CARD結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domains)，結(jié)合非帽化的RNA后與同樣含有CARD結(jié)構(gòu)域的線粒體抗病毒蛋白（mitochondrial antiviral signaling，MAVS）結(jié)合，導致MAVS和IKK激酶（I B kinase）結(jié)合，然后以此為平臺募集下游不同的信號分子組成不同的調(diào)控復(fù)合物，最終激活核因子B（nuclear factor-kappaB，NF-B）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulated factor，IRF3），進而起始-干擾素（interferon-β，IFN-）的表達及IFN介導的抗病毒免疫。RIG-I信號通路受泛素化、去泛素化、磷酸化以及去磷酸化的調(diào)控。前期報道腫瘤抑制因子圓柱瘤基因（Cylindromatosis，CYLD）可以通過調(diào)控RIG-I的泛素化參與宿主的先天性免疫應(yīng)答信號傳導途徑。在樹突狀細胞（Dendritic cells, DC）中缺失CYLD會誘導持續(xù)泛素化RIG-I，并增強TANK結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase1，TBK1）和IκB激酶（The IκB kinase，IKK）的活性。除了RIG-I, CYLD同樣能去除核因子Kappa B基本調(diào)節(jié)因子（Nuclear factor-Kappa B essential modulator，NEMO）、IKK、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor-associated factor2，TRAF2）以及B細胞淋巴瘤蛋白3（B-cell CLL/lymphoma3，Bcl-3）的K63位泛素化來負調(diào)控NF-B和c-Jun N末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路。這些發(fā)現(xiàn)確定了CYLD成為抗病毒先天性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控分子。 MicroRNA（miRNA）是一類高度保守的非編碼小RNA分子，平均長度為22nt（nucleotide，nt）。miRNA通過與靶基因的3’UTR（untranslational region，UTR）結(jié)合來抑制基因表達。miRNA參與調(diào)節(jié)許多生命進程，發(fā)揮重要的作用。近來報道了在單核細胞核巨噬細胞中miRNA參與調(diào)控先天性免疫應(yīng)答，如miR-146a靶向白介素1受體相關(guān)激酶1（IL-1R associated kinase1，IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor6，TRAF6）來負調(diào)控RIG-I樣受體（RIG-I-like receptor，RLR）信號通路。然而到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于EV71通過miRNA調(diào)控RIG-I信號通路的報道。本研究發(fā)現(xiàn)： 1. miR-526a的表達受RNA病毒誘導激活的IRF3/7轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控：利用熒光定量PCR(quantitative polymerase chain reactin，q-PCR)的方法，發(fā)現(xiàn)RNA病毒感染可以顯著促進細胞內(nèi)miR-526a的表達；通過RNA干涉手段，發(fā)現(xiàn)IRF3、7敲低細胞中水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）誘導的miR-526a上調(diào)被顯著抑制，以上結(jié)果提示我們miR-526a的表達受RNA病毒誘導激活的IRF3/7轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。 2. miR-526a促進RIG-I信號通路的激活：通過合成miR-526a模擬物以及抑制劑，利用IFN-、NF-B以及IRF3報告基因活性檢測方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以顯著增強RIG-I信號通路的激活，這種激活活性可以被miR-526a抑制劑阻斷；利用q-PCR以及AlphaLISA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-526a能夠促進病毒誘導的IFN-的轉(zhuǎn)錄和分泌；利用q-PCR方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a的過表達能夠激活I(lǐng)FN-的下游誘導基因ISG56、ISG54、白介素-8（interleukin-8，IL-8）以及趨化因子配體-2（Chemokine (C-X-C motif) ligand2，CXCL-2）的表達，以上結(jié)果顯示miR-526a是參與調(diào)控RIG-I信號通路的正調(diào)控因子。 3.miR-526a抑制VSV和NDV病毒的復(fù)制：用免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物能夠抑制VSV病毒感染后VSV-G蛋白的表達；以新城疫病毒NDV-GFP（Newcastle Disease Virus，NDV）病毒感染細胞為模型，利用熒光顯微鏡以及流式細胞術(shù)檢測方法發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以顯著抑制NDV病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制，以上結(jié)果提示我們miR-526a可以抑制RNA病毒復(fù)制。 4.miR-526a通過靶向CYLD激活RIG-I信號通路：通過生物信息學軟件TargetScan等預(yù)測，發(fā)現(xiàn)CYLD是miR-526a潛在的靶點。檢測帶有不同位置的CYLD3’UTR熒光素酶報告基因的活性發(fā)現(xiàn)CYLD存在miR-526a作用位點；利用q-PCR以及免疫印跡方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物能夠下調(diào)CYLD的轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白水平。利用細胞泛素化實驗，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以增強病毒誘導的RIG-I K63位泛素化水平，而miR-526a抑制劑可以抑制病毒誘導的RIG-I的泛素化；利用免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以增強病毒誘導的IKK/、I B及IRF3的磷酸化，以上實驗說明miR-526a通過靶向CYLD增強RIG-I的K63位泛素化修飾，進而激活RIG-I信號通路。 5. EV71病毒利用3C蛋白酶靶向miR-526a抑制RIG-I信號通路的激活：利用q-PCR以及免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)EV71病毒感染后下調(diào)miR-526a的表達、IRF7的激活以及IFN-的產(chǎn)生，以上表型均由EV71的3C蛋白酶介導；通過免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物及CYLD的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)能夠抑制EV71病毒的復(fù)制以及EV71VP1蛋白的表達，以上結(jié)果說明EV71通過靶向miR-526a阻斷RIG-I信號通路的激活。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)病毒感染巨噬細胞后能顯著上調(diào)miR-526a，并依賴IRF3/7的激活。而miR-526a通過靶向CYLD，去除RIG-I的K63位泛素化正調(diào)控VSV介導的IRF3和NF-B的激活。進一步發(fā)現(xiàn)了EV71的3C蛋白酶能夠抑制miR-526a的表達，過表達miR-526a能夠抑制EV71的復(fù)制。因此本研究第一次發(fā)現(xiàn)了miR-526a是RIG-I信號通路的一個正調(diào)控因子，并且EV71通過抑制miR-526a來抑制RIG-I介導的IFN-I產(chǎn)生。
【學位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
目錄
縮略詞表
摘要
Abstract
前言
    一、EV71 逃逸宿主天然免疫與其致病性
    二、RLR 信號通路與抗病毒感染
    三、microRNA 參與先天性免疫應(yīng)答
    四、本課題研究的科學問題
材料與方法
    1 材料
        1.1 細胞株
        1.2 菌毒株、質(zhì)粒與 RNA 合成物
        1.3 常用試劑盒
        1.4 分子生物學及細胞生物學試劑
        1.5 抗體
        1.6 其它化學試劑
        1.7 主要實驗儀器
    2 實驗方法
        2.1 病毒擴增
        2.2 病毒感染
        2.3 細胞培養(yǎng)
        2.4 RNA 提取
        2.5 反轉(zhuǎn)錄
        2.6 熒光定量 PCR
        2.7 CYLD 3’UTR luciferase 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.8 luciferase reporter 檢測
        2.9 免疫沉淀
        3.0 免疫印跡
        3.1 流式細胞術(shù)檢測
        3.2 AlphaLISA 檢測 IFN- 水平
        3.3 統(tǒng)計學分析
結(jié)果
    1 miR-526a 的表達受 RNA 病毒誘導激活的 IRF3/7 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控
    2 miR-526a 促進 RIG-I 信號通路的激活
    3 miR-526a 抑制 VSV、NDV 及 EV71 病毒的復(fù)制
    4 miR-526a 通過靶向 CYLD 激活 RIG-I 信號通路
討論
結(jié)論
參考文獻
文獻綜述
    摘要
    Abstract
    參考文獻
代表性論文
個人簡歷
致謝

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 毛理凱,漆安慎;第三次免疫應(yīng)答的研究[J];北京師范大學學報(自然科學版);2001年02期

2 韓之波,任賀,楊仁池;瘦素與免疫應(yīng)答[J];國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊);2005年03期

3 陳坤;徐紅梅;;糖原合酶-3對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用[J];中國腫瘤生物治療雜志;2010年05期

4 蔡訪勤;呼吸道的免疫應(yīng)答[J];國外醫(yī)學.呼吸系統(tǒng)分冊;1982年04期

5 吳振榮,鐘學寬,許永麗,周令望,武常莉;低硒兒童的免疫應(yīng)答[J];哈爾濱醫(yī)科大學學報;1989年06期

6 Mara Rossini;黃海根;;基因轉(zhuǎn)移小鼠在免疫應(yīng)答研究中的應(yīng)用[J];上海實驗動物科學;1991年01期

7 涂文偉,楊錫強;細胞因子的免疫應(yīng)答調(diào)控及其臨床意義[J];國外醫(yī)學(兒科學分冊);1993年05期

8 朱云娟;旋毛蟲和假旋旋毛蟲在小鼠引起的免疫應(yīng)答[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);1995年06期

9 Moll H ,詹艷愛 ,朱振勤;對寄生蟲免疫應(yīng)答利與弊的區(qū)別[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);1997年06期

10 丁潔,吳咸中;一氧化氮與免疫應(yīng)答[J];中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志;1998年04期

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 史皆然;胞壁型重組BCG的構(gòu)建及對小鼠免疫應(yīng)答的影響[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;2003年

2 董生福;人工合成寡糖促進乙型肝炎病毒抗原誘導免疫應(yīng)答的研究[D];復(fù)旦大學;2007年

3 李珣;以DNA為基礎(chǔ)的復(fù)合免疫接種誘導小鼠抗AMA1免疫應(yīng)答[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;2003年

4 董慧;抗原靶向不同樹突細胞亞群誘導抗結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答的研究[D];揚州大學;2010年

5 呂翠芳;幾類具免疫應(yīng)答的HIV-1動力學模型研究[D];湖南大學;2014年

6 劉志華;用腺病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移研究HBV/C區(qū)熱點變異對小鼠免疫應(yīng)答的影響[D];第一軍醫(yī)大學;2002年

7 林莉;miR-145促進天然免疫應(yīng)答中巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素10及其表觀遺傳機制研究[D];浙江大學;2011年

8 劉娟;Rhbdd3分子在免疫應(yīng)答調(diào)控中的作用及其機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2012年

9 盧燕來;人γδT細胞對A型流感病毒血凝素蛋白及假病毒的免疫應(yīng)答研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

10 朱旭輝;DNMT1和CLM-3在天然免疫應(yīng)答中的功能及機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2013年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 文科;鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白刺激小鼠細胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答及鞭毛蛋白佐劑效應(yīng)的初步研究[D];揚州大學;2009年

2 彭臻菲;兩性葡聚糖免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)機制研究[D];福州大學;2006年

3 李金波;HCV HVR1模擬肽誘導小鼠免疫應(yīng)答及機制的初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2008年

4 岳翔;參與先天性免疫應(yīng)答的miRNA的鑒定及其功能的初步研究[D];安徽大學;2012年

5 王棟;小鼠胸腺對納米級化學異物與異種細胞的免疫應(yīng)答[D];山東大學;2013年

6 曹艷紅;具有免疫應(yīng)答和細胞內(nèi)部時滯的HIV感染模型的穩(wěn)定性分析[D];南華大學;2011年

7 趙穩(wěn);HIV-1抗原特異性CTL免疫應(yīng)答影響因素的研究[D];廣州醫(yī)學院;2010年

8 李玉芬;維生素A對小鼠Th1/Th2免疫應(yīng)答模式平衡影響的研究[D];吉林大學;2004年

9 秦雅楠;Bcr/Abl和hIL-2雙基因表達載體的構(gòu)建和小鼠免疫應(yīng)答研究[D];暨南大學;2012年

10 王沉;免疫應(yīng)答對大鼠痛閾及電針鎮(zhèn)痛的影響[D];遼寧中醫(yī)學院;2001年

本文編號：2879217