目的:研究人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta derived mesenchymal stem cells,hPMSCs)對人源化移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)小鼠模型體內(nèi)CD4+IL-10+IFN-y+T細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化及血清中IL-27、IFN-γ和IL-10水平的影響;探討IL-27對hPMSCs誘導(dǎo)CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化的作用及機制;分析IFN-γ對hPMSCs的黏附、增殖、遷移以及其對不同調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)亞群調(diào)節(jié)作用的影響。方法:1.采用6-8周齡的非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)構(gòu)建人源化GVHD模型,隨后用hPMSCs干預(yù)治療。分別于治療后第7、14天將小鼠處死取材。2.流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)分析脾臟、肝臟中CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群比例變化。3.ELISA法檢測血清中IL-27、IFN-γ及IL-10水平。4.蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法觀察肺臟、腎臟的組織形態(tài)學(xué)改變。5.體外應(yīng)用FCM檢測①IL-27受體(IL-27receptor,IL-27R)在hPMSCs上的表達(dá),②IL-27對hPMSCs誘導(dǎo)CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群形成的調(diào)節(jié)作用,③IFN-γ對hPMSCs誘導(dǎo)CD4+CXCR5+Foxp3+等Treg亞群轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用。6.IL-27對hPMSCs上程序性死亡配體2(programmed death ligand 2,PDL2)的調(diào)節(jié)作用及其信號通路通過FCM及Westen blot分析。7.實時細(xì)胞分析(real-time cell analysis,RTCA)儀實時動態(tài)檢測 IFN-y 對 hPMSCs 黏附、增殖和遷移的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果:1..hPMSCs可誘導(dǎo)CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群的形成,并改善人源化GVHD小鼠的臨床癥狀(1)hPMSCs與植物血凝素(PHA)活化的健康人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)共培養(yǎng)后,CD4+IL-10+IFN-γT 細(xì)胞亞群在PBMC中的比例明顯高于PHA單獨活化PBMC組。(2)成功構(gòu)建人源化GVHD小鼠模型。(3)FCM結(jié)果表明,與PBS對照組相比,hPMSCs干預(yù)后,小鼠肝臟中CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群升高比例明顯高于脾臟(P0.01)。(4)細(xì)胞因子分析結(jié)果顯示,與PBS對照組相比,hPMSCs治療7天后IL-10水平明顯提高(P0.01),而IL-27、IFN-γ水平明顯降低(P0.01);且hPMSCs治療14天后細(xì)胞因子改變更加顯著。(5)HE染色結(jié)果顯示,與PBS對照組相比,hPMSCs干預(yù)后小鼠肺臟、腎臟的形態(tài)學(xué)改變明顯減輕。(6)相比于PBS組,GVHD小鼠經(jīng)hPMSCs干預(yù)后體重明顯增加(P0.001),行為學(xué)評分顯著降低(P0.001),生存期明顯延長(P0.001)。2.IL-27可促進(jìn)hPMSCs誘導(dǎo)CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群的形成(1)FCM結(jié)果表明hPMSCs表達(dá)IL-27R。(2)相比于未處理組,經(jīng)IL-27預(yù)處理hPMSCs后,CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群在PBMC中的比例明顯升高。(3)IL-27可通過JAK/STAT信號通路上調(diào)PDL2在hPMSCs上的表達(dá)。3.IFN-y可調(diào)節(jié)hPMSCs的黏附、增殖、遷移,促進(jìn)hPMSCs誘導(dǎo)不同的Treg亞群形成(1)hPMSCs增殖及遷移的細(xì)胞指數(shù)分別于與IFN-y(10 ng/ml,20 ng/ml,30 ng/ml)共培養(yǎng)64 h及20 h后下降。而IFN-γ與hPMSCs共培養(yǎng)對其黏附的細(xì)胞指數(shù)無影響。(2)hPMSCs可上調(diào)CD4+CXCR5+Foxp3+T細(xì)胞亞群在PBMC中百分比,且經(jīng)IFN-γ干預(yù)后,此亞群的比例可進(jìn)一步升高。(3)hPMSCs經(jīng)IFN-γ干預(yù)后再與活化的PBMC共培養(yǎng)后,CD4+CXCR5+Foxp3+T細(xì)胞亞群的百分比增長倍數(shù)明顯高于 CD4+CD25+Foxp3+,CD8+CD25+Foxp3+,CD4+IL-10+和CD8+IL-10+T細(xì)胞亞群。結(jié)論:1.hPMSCs可通過誘導(dǎo)CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群,平衡血清中IL-27、IFN-y和IL-10水平,進(jìn)而減輕GVHD小鼠的臨床癥狀。2.IL-27可通過JAK/STAT通路上調(diào)PDL2在hPMSCs上的表達(dá),進(jìn)而增強hPMSCs對CD4+IL-10+IFN-γ+T細(xì)胞亞群的誘導(dǎo)形成作用。3.IFN-y可抑制hPMSCs的增殖以及遷移,且IFN-y可提高h(yuǎn)PMSCs誘導(dǎo)活化的PBMC向不同的Treg亞群轉(zhuǎn)化的作用。IFN-y預(yù)處理hPMSCs后,相比于CD4+CD25+Foxp3+,CD8+CD25+Foxp3+,CD4+IL-10+和 CD8+IL-10+T 細(xì)胞亞群,hPMSCs對CD4+CXCR5+Foxp3+T細(xì)胞亞群的誘導(dǎo)形成能力最強。
【學(xué)位單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

成功構(gòu)建模型后，ｈＰＭＳＣｓ經(jīng)尾靜脈輸注用于治療，同時使用ＰＢＳ干預(yù)??作為對照。分別于ＧＶＨＤ小鼠到達(dá)發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)及ｈＰＭＳＣｓ分別治療７和１４天后將??小鼠處死后，取小鼠的脾臟、肝臟、腎臟、肺臟及血清，進(jìn)行相應(yīng)的實驗（圖１??Ｂ）。??Ａ?Ｂ??Ｃｏｕｄｉｔｉｏｕｍｇ?ｒｅｇｕｕｅｕ?Ｌ?ｄ？ｙ?１８??ｍ＜?ａＡＳＧＭ．?，ＰＢＳｄ＞ｙ＂?＞?＿??？＿，?２｜?卜３?叫?乂?＾?—??ＮＯＤ／ＳＣＩＤ?Ｔｒａｍｆｕｓｉｏｕ?Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ?ＧＶＨＩ＞＊＾?ｄａｙ?１８??１??ｈＰＭＳＣｓ?ｄａｙ?１１??ｄ？ｙ２５??圖１－１小鼠分組、人源化ＧＶＨＤ小鼠誘導(dǎo)和ｈＰＭＳＣｓ干預(yù)流程。（Ａ）ＮＯＤ／ＳＣｌＤ小??鼠在第１、２天腹腔注射ＣＴＸ，第３天注射ＮＫ細(xì)胞抑制劑。（Ｂ）尾靜脈注射ＰＢＭＣ誘導(dǎo)??人源化ＧＶＨＤ模型。注射ＰＢＭＣＩ１天后，模型誘導(dǎo)成功，分別使用ＰＢＳ和ｈＰＭＳＣｓ經(jīng)尾靜??脈輸注進(jìn)行干預(yù)。分別于干預(yù)７天及１４天后，處死小鼠取材。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－?１?Ｇｒｏｕｐ?ｄｉｖｉｓｉｏｎ?ａｎｄ?ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ?ｆｏｒ?ｘｅｎｏ－ＧＶＨＤ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．?（Ａ）?ＮＯＤ／ＳＣＩＤ?ｍｉｃｅ??ｒｅｃｅｉｖｅｄ?ＣＴＸ?ｆｏｒ?ｄａｙｓ?１?ｔｏ?２?ａｎｄ?ａｎｔｉ－ａＡＳＧＭｌ?ｆｏｒ?ｄａｙ?３．?（Ｂ）?ＰＢＭＣ?ｗｅｒｅ?ｉｎｊｅｃｔｅｄ?ｔｏ?ｍｉｃｅ?ｔｏ??ｂｕｉｌｄ?ｔｈｅ?ｘｅｎｏ－ＧＶＨＤ?ｍｏｄｅｌ．?Ａｆｔｅｒ?１１?ｄａｙｓ

２、ｈＰＭＳＣｓ對ＣＩ）４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－ｙ＋Ｔ細(xì)胞的體內(nèi)外調(diào)節(jié)作用??體外實驗結(jié)果顯示，ｈＰＭＳＣｓ與活化ＰＢＭＣ共培養(yǎng)后，ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－Ｙ＋Ｔ??細(xì)胞在ＰＢＭＣ中的百分比顯著升高相比于活化ＰＢＭＣ組（ｐ＜０．０１，圖１－４Ａ，Ｂ）。??ＰＢＭＣ通過尾靜脈成功誘導(dǎo)人源化ＧＶＨＤ模型后，使用ｈＰＭＳＣｓ治療７天??后，發(fā)現(xiàn)與ＰＢＳ組相比，ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－Ｙ＋Ｔ細(xì)胞的在脾臟及肝臟中的比例明顯??２５??

?ＰＢＭＣ?ＧＶＨＤ＾?Ｄａｙ?７?Ｄａｙ?１４?、、＾５?＾?＾?必、？??…、氣ｖ？：ｙ??圖１－４?１＾１＾＃刀冤柀枺矗?福?保埃??啵保埽保?荊?∠赴?奶迥諭獾鶻謐饔謾＃保壁啵保蓿福３與活化卩８�。埽矗�?共培養(yǎng)后，ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－ｙ＋Ｔ細(xì)胞亞群在ＰＢＭＣ中百分比的流式代表圖（Ａ）及百分?jǐn)?shù)（Ｂ）。??不同組別小鼠脾臟（Ｃ）及肝臟（Ｄ）中ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋１ＦＮ－ｙ＋Ｔ細(xì)胞亞群的流式代表圖。不同??組別小鼠脾臟（Ｅ）和肝臟（Ｆ）中ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－ｙ＋Ｔ細(xì)胞亞群的的百分?jǐn)?shù)。（Ｇ）不同組??別小鼠脾臟及肝臟中ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－Ｙ＋Ｔ細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)的比較。（＊ｐ＜０．０５
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本文編號：2869063