發(fā)布時間：2017-04-05 08:10

  本文關鍵詞：不同程度過氧化氫通過線粒體ROS調(diào)控PC12細胞存活與死亡的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：傳統(tǒng)觀點認為,線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,m ROS)的作用僅僅是引起細胞損傷而導致眾多疾病的發(fā)生,因此m ROS被認為是氧化代謝中的一種有害產(chǎn)物而缺少正常的生理功能。然而,越來越多的研究表明,m ROS在維持正常細胞功能中也發(fā)揮關鍵作用,例如,在缺氧、饑餓、病原體感染以及生長因子刺激下通常誘導細胞產(chǎn)生m ROS,轉(zhuǎn)而激活下游m ROS-依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑,后者具有維持細胞穩(wěn)態(tài)和促進細胞應對刺激適應性的功能。有研究報道氧化應激能擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能,活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及下游的自噬過程。根據(jù)氧化應激嚴重程度的不同,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其后續(xù)活化的自噬可發(fā)揮促細胞存活或死亡的雙重作用。大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞是一個體外研究神經(jīng)細胞的常用模型。當培養(yǎng)基中有動物血清存在時,PC12細胞呈圓形、胞體明亮、迅速增殖。在此條件下,PC12細胞表現(xiàn)出許多不成熟神經(jīng)細胞特性,可以轉(zhuǎn)變成腎上腺嗜鉻細胞,也可以變成交感樣神經(jīng)細胞。在神經(jīng)生長因子誘導下,PC12細胞能分化成交感神經(jīng)樣細胞,具有神經(jīng)元的形態(tài)、生化和生理特征。PC12細胞的這些特性使得它成為研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制以及探索相關治療手段的一種簡單且便利的細胞模型。本實驗以PC12細胞作為研究對象,采用不同濃度H2O2模擬不同程度氧化應激,探討在不同程度氧化應激條件下,線粒體ROS以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-自噬途徑相關聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導在調(diào)控神經(jīng)細胞存活與死亡過程中的作用。方法和結(jié)果:1、不同濃度H2O2刺激PC12細胞6h后,MTT實驗檢測細胞存活率。結(jié)果顯示:與對照組相比,較低濃度H2O2刺激下PC12細胞的存活率無顯著變化;高濃度H2O2刺激下PC12細胞的存活率顯著降低。2、分別采用低濃度H2O2以及高濃度H2O2刺激PC12細胞6h,倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示:與對照組相比,低濃度H2O2刺激不引起光學顯微鏡下可見的細胞形態(tài)改變;高濃度H2O2刺激引起細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。3、分別采用低濃度H2O2以及高濃度H2O2刺激PC12細胞6h,應用western blot檢測細胞凋亡指示蛋白caspase-3的表達情況。結(jié)果顯示:與對照組相比,低濃度H2O2刺激不改變caspase-3的活化即不引起細胞凋亡發(fā)生;高濃度H2O2刺激顯著增加caspase-3的活化,即誘導細胞發(fā)生凋亡。4、分別采用低濃度H2O2以及高濃度H2O2刺激PC12細胞6h,應用流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電勢的變化。結(jié)果顯示:與對照組相比,低濃度H2O2刺激使PC12細胞的線粒體膜電勢輕度降低;高濃度H2O2刺激使得PC12細胞的線粒體膜電勢極顯著降低。5、分別采用低濃度H2O2以及高濃度H2O2刺激PC12細胞6h,應用熒光染料Mito SoxTM紅色試劑標記線粒體ROS。結(jié)果顯示,不同程度H2O2刺激對PC12細胞線粒體ROS水平產(chǎn)生不同影響:與對照組相比,低濃度H2O2刺激使PC12細胞中線粒體ROS水平降低;高濃度H2O2刺激使PC12細胞中線粒體ROS水平顯著增加。6、分別采用低濃度H2O2以及高濃度H2O2刺激PC12細胞6h,應用western blot檢測線粒體介導的凋亡途徑相關信號蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,不同程度H2O2刺激對PC12細胞的線粒體-介導的凋亡信號通路產(chǎn)生不同影響:與對照組相比,低濃度H2O2刺激上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,不影響線粒體凋亡蛋白caspase-9的表達;高濃度H2O2刺激顯著降低Bcl-2的表達,同時顯著上調(diào)caspase-9的表達。7、分別采用低濃度H2O2以及高濃度H2O2刺激PC12細胞6h,應用western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-自噬通路中相關蛋白的表達情況。結(jié)果顯示:與對照組相比,低濃度H2O2刺激上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志蛋白GRP78的表達,不影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑的凋亡蛋白CHOP的表達以及自噬相關蛋白LC3、P62的表達;高濃度H2O2刺激顯著上調(diào)GRP78、CHOP、LC3、P62蛋白的表達。結(jié)論:細胞應對不同程度氧化應激刺激時調(diào)動不同的應答反應。輕度氧化應激條件下,通過線粒體途徑(降低線粒體ROS,上調(diào)抗凋亡Bcl-2信號)維持細胞的穩(wěn)定狀態(tài);重度氧化應激條件下,通過線粒體ROS以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-自噬途徑同時觸發(fā)死亡信號,誘導細胞發(fā)生線粒體介導的凋亡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡。
【關鍵詞】：過氧化氫 PC12細胞 線粒體ROS 凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-自噬途徑
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R363
【目錄】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-15
• 英文縮寫詞15-16
• 第1章 文獻綜述16-29
• 1.1 氧化應激概述16-17
• 1.2 PC12細胞概述17-18
• 1.3 凋亡概述18-19
• 1.4 線粒體ROS概述19-23
• 1.4.1 線粒體產(chǎn)生ROS20
• 1.4.2 線粒體ROS的調(diào)節(jié)20-23
• 1.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與自噬概述23-29
• 1.5.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與未折疊蛋白反應23-25
• 1.5.2 自噬25-27
• 1.5.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與自噬的聯(lián)系27-29
• 第2章 實驗材料與方法29-37
• 2.1 實驗材料29-31
• 2.1.1 儀器29-30
• 2.1.2 試劑30-31
• 2.2 實驗方法31-37
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)31-32
• 2.2.2 MTT法檢測細胞存活率32
• 2.2.3 倒置光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)32-33
• 2.2.4 Bradford試劑盒測定細胞總蛋白濃度33
• 2.2.5 RIPA法提取細胞中總蛋白33-34
• 2.2.6 蛋白免疫印跡實驗34-35
• 2.2.7 JC-1 試劑盒檢測線粒體膜電勢35
• 2.2.8 MiToSox~(TM)試劑盒檢測線粒體超氧化物的生成35-36
• 2.2.9 統(tǒng)計學方法36-37
• 第3章 實驗結(jié)果37-45
• 3.1 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞存活與死亡的影響37-38
• 3.1.1 不同濃度H_2O_2刺激對PC12細胞存活率的影響37
• 3.1.2 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞形態(tài)的影響37-38
• 3.2 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞存活與凋亡的影響38-39
• 3.3 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞線粒體ROS-介導信號的影響39-42
• 3.3.1 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞線粒體膜電勢的影響39-40
• 3.3.2 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞線粒體ROS水平的影響40-41
• 3.3.3 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞線粒體凋亡關聯(lián)蛋白的影響41-42
• 3.4 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-自噬通路的影響42-45
• 3.4.1 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路相關蛋白的影響42-43
• 3.4.2 不同程度H_2O_2刺激對PC12細胞自噬通路相關蛋白的影響43-45
• 第4章 討論45-50
• 第5章 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-62
• 致謝62

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