目的:使用嗜熱二型內(nèi)含子基因失活系統(tǒng)(Thermotargetron)失活人腸道來源大腸桿菌(HSM174 DE3)β-半乳糖苷酶基因(LacZ),構(gòu)建lacZ失活突變株。方法:使用分子克隆方法,構(gòu)建lacZ基因失活質(zhì)粒pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s,將基因失活質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HSM174菌株(E.coli HSM174),轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)時提高溫度至48℃,誘導(dǎo)TeI3c/4c二型內(nèi)含子"歸巢"活性,采用藍(lán)白斑及PCR篩選lacZ基因失活突變株。結(jié)果:隨機挑選20株克隆菌株的PCR結(jié)果顯示,lacZ426a、lacZ1879a、lacZ1880a及l(fā)acZ1155s基因失活效率分別為60%、75%、60%及75%;白斑克隆基因失活效率為100%。結(jié)論:Thermotargetron系統(tǒng)可高效的實現(xiàn)E.coli HSM 174菌株lacZ基因失活,并可能具有在中溫菌中廣泛應(yīng)用的潛力。
【部分圖文】：

E. coli HSM174 lacZ 基因(ECHMS174_00351)全長3 075 bp,在lacZ基因中5′-AAcgccatcaaaaatA-3′(426a)、5′-AAcggaactggaaaaA-3′(1 879a)、5′-AAa-cggaactggaaaA-3′(1 880a)及5′-AAgcagaacaactttA-3′(1 155s)四個位點符合TeI3c/4c識別規(guī)律(圖1A)。使用引物突變野生型TeI3c/4c IBS1、IBS2、EBS1及EBS2位點(圖1B),構(gòu)建針對lacZ基因426a,1 879a,1 880a和1 155s四個識別位點的打靶質(zhì)粒pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s(圖1)。2.2 E. coli HSM174 lacZ 基因敲除載體的構(gòu)建

pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s載體轉(zhuǎn)化E. coli HSM174感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化效率=104 CFU/μg DNA。轉(zhuǎn)化子在LB-Chl的平板上(添加X-gal)形成白色和藍(lán)色的克隆(圖3A, 圖3B)。使用lacZ基因外側(cè)引物(DPlacZ-F/R)檢測白色克隆,突變株因TeI3c/4c插入,PCR檢測產(chǎn)物分子量比野生型大(WT=3176 bp vs mutant=3 976 bp,圖3C),白色克隆lacZ失活率為100%(圖3C)。為了計算突變效率,轉(zhuǎn)化子被涂布在LB-Chl平板上,隨機挑選20個轉(zhuǎn)化子克隆(培養(yǎng)基中不加入X-gal)檢測lacZ基因是否插入失活。結(jié)果顯示pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s打靶載體的基因失活效率分別為60%、75%、60%和75%(表4)。表1 菌株序列(特征)及來源Tab.1 Strain sequence (characteristics) and its origin 菌株 序列或特征 來源 HMS174(DE3) F- recA1 hsdR(rK12- mK12+) (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) (Rif R) Novagen NEB express competent E. coli (high efficiency) fhuA2 [Ion] ompT gal sulA11R(mcr-73::miniTn10--TetS)2[dcm]R(zgb-210::Tn10--TetS)endAdelta(mcrC-mrr)114::IS10 NEB HMS174(DE3) lacZ::lacZ426a HMS174(DE3) 來源,lacZ::lacZ426a 本研究 HMS174(DE3) lacZ::lacZ1155s HMS174(DE3) 來源,lacZ::lacZ1155s 本研究 HMS174(DE3) lacZ::lacZ1880a HMS174(DE3) 來源,lacZ::lacZ1880a 本研究 HMS174(DE3) lacZ::acZ1879a HMS174(DE3) 來源,lacZ::acZ1879a 本研究

表3 引物序列(特征)及來源Tab.3 Sequence (characteristics) and Source of primers 引物 序列或特征 來源 lacZ426aIBS12 AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAcgccatcaaaaatGTGCGACGCGAAAGCTAG 本研究 lacZ426aEBS2s CGCTAGAAGCCTCGTTAtggcgAGCAGGCCAAAGATGCTG 本研究 lacZ426aEBS1a CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAaaaaatAGCAGCGtATCCAATCC 本研究 LacZ1879aIBS12 AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAcggaactggaaaaGTGCGACGCGAAAGCTAG 本研究 LacZ1879aIBS2s CGCTAGAAGCCTCGTTAttccgAGCAGGCCAAAGATGCTG 本研究 LacZ1879aIBS1a CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAggaaaaAGCAGCGtATCCAATCC 本研究 lacZ1880aIBS12 AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAacggaactggaaaGTGCGACGCGAAAGCTAG 本研究 lacZ1880aEBS2s CGCTAGAAGCCTCGTTAtccgtAGCAGGCCAAAGATGCTG 本研究 lacZ1880aEBS1a CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAtggaaaAGCAGCGtATCCAATCC 本研究 LacZ1155sIBS12 AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAgcagaacaactttGTGCGACGCGAAAGCTAG 本研究 LacZ1155sIBS2s CGCTAGAAGCCTCGTTAtctgcAGCAGGCCAAAGATGCTG 本研究 LacZ1155sIBS1a CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAaactttAGCAGCGTATCCAATCC 本研究 Tel3cUNV TAACGAGGCTTCTAGCG 文獻[1] DPlacZ-F TTACGCGAAATACGGGCAG 本研究 DPlacZ-R CTTCCGGCTCGTATGTTGT 本研究表4 Thermotargetron失活lacZ基因Tab.4 Thermoargtron-inactivated lacZ gene 打靶質(zhì)粒 打靶基因 長度(bp) 識別序列 失活效率(%) pHK-TT1A-lacZ426a lacZ 3 075 CGCCATCAAAAAT 60 pHK-TT1A-lacZ1879a lacZ 3 075 CGGAACTGGAAAA 75 pHK-TT1A-lacZ1880a lacZ 3 075 ACGGAACTGGAAA 60 pHK-TT1A-lacZ1155s lacZ 3 075 GCAGAACAACTTT 75
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本文編號：2864500