目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有向成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種成熟細(xì)胞分化的潛能，其來(lái)源豐富，分離、培養(yǎng)較為容易，在體外可多次擴(kuò)增，自體移植不存在組織配型及免疫排斥的問(wèn)題。由于MSCs具有上述優(yōu)點(diǎn)，使其引起了廣泛的關(guān)注，尤其是組織修復(fù)方面，可將其應(yīng)用于器官及組織的修復(fù)治療中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同條件下分離、純化、傳代、鑒定及誘導(dǎo)，得出培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件。并進(jìn)一步用5-氮雜胞苷（5-Aza-CR）誘導(dǎo)其向成肌細(xì)胞分化，將誘導(dǎo)后的干細(xì)胞用BrdU標(biāo)定，移植入SD大鼠膀胱肌層，觀察其在膀胱肌層的存活及分布狀況。 方法：(1) MSCs的分離培養(yǎng)(2) MSCs的鑒定(3) MSCs的傳代培養(yǎng)(4)不同種植密度對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響(5)不同濃度胎牛血清對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響(6)傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(7)5-Aza-CR誘導(dǎo)MSCs分化為成肌細(xì)胞(8) MSCs受5-Aza-CR誘導(dǎo)后肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)(9) BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定(10)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植 結(jié)果：(1) MSCs的分離培養(yǎng)脫頸處死6周齡SD大鼠1只，75％酒精浸泡5min滅菌，取出大鼠雙側(cè)脛骨及股骨，剪去長(zhǎng)骨兩端，暴露骨髓腔，5ml注射器反復(fù)沖洗得到單細(xì)胞懸液，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。根據(jù)MSCs與雜質(zhì)細(xì)胞的貼壁時(shí)間差純化干細(xì)胞，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始貼壁變形，原代干細(xì)胞呈圓形、三角形、多角形，雜質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈圓形或不貼壁。培養(yǎng)48h后,顯微鏡下觀察可見(jiàn)貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，部分呈集落樣生長(zhǎng)。培養(yǎng)4～6d后,貼壁細(xì)胞分裂增殖明顯,可見(jiàn)較多的分裂相,隨著細(xì)胞數(shù)目增多，二維生長(zhǎng)的干細(xì)胞群內(nèi)空間趨于狹窄，故出現(xiàn)漩渦樣，成纖維樣細(xì)胞集落。(2) MSCs的鑒定對(duì)干細(xì)胞的鑒定仍然是一個(gè)難題，目前尚無(wú)統(tǒng)一的、權(quán)威的標(biāo)準(zhǔn)。目前的現(xiàn)狀是，大多數(shù)人采用聯(lián)合應(yīng)用多種抗體分離鑒定MSCs，一般采用排除法或推逆法對(duì)其進(jìn)行鑒定。目前最常用的間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記物有：SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105、CD166等；陰性標(biāo)記物有：CD14、CD34、CD45、CD34、CD31、VWF等，本實(shí)驗(yàn)選擇CD29，CD44作為陽(yáng)性標(biāo)記物，CD34，CD45作為陰性標(biāo)記物，以免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞特異性抗原。(3) MSCs傳代培養(yǎng)10-14天，細(xì)胞密度逐步增加，融合成片。傳代接種后的細(xì)胞分布均勻，以梭狀為主。傳1、2代的MSCs形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，雜質(zhì)細(xì)胞隨傳代、換液逐漸減少。培養(yǎng)至傳P8(傳八代)細(xì)胞，干細(xì)胞仍然存活，但細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)開(kāi)始變化，折光性較差，開(kāi)始脫壁凋亡。(4)不同種植密度對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響在106/ml密度接種時(shí)MTT比色法檢測(cè)OD490值最大，活細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞活性較好，較利于MSCs的生長(zhǎng)。(5)不同濃度胎牛血清對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響在10%～15%的胎牛血清濃度時(shí)MTT比色法檢測(cè)OD490最高，證明10%～15%血清濃度最適宜MSCs生長(zhǎng)。(6)傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形，增殖包括滯留期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期三個(gè)時(shí)期，P1(傳一代)細(xì)胞增殖較快，其速度明顯快于其他時(shí)期。(7)5-Aza-CR誘導(dǎo)MSCs最適濃度測(cè)定及誘導(dǎo)效果不同濃度5-Aza-CR誘導(dǎo)MSCs，在10umol/L的濃度時(shí)MTT比色法檢測(cè)OD490最高，證明10umol/L5-Aza-CR濃度最適宜MSCs誘導(dǎo)。以10umol/L5-Aza-CR誘導(dǎo)傳MSCs，4d后未發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞胞體明顯變化，10d見(jiàn)小部分細(xì)胞胞體增大、變長(zhǎng)，13d可見(jiàn)部分細(xì)胞相互接觸，至15d-17d可見(jiàn)有類(lèi)肌管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。(8) MSCs受5-Aza-CR誘導(dǎo)后肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)后的細(xì)胞4d檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)肌細(xì)胞特異抗原，誘導(dǎo)后的細(xì)胞12d后，細(xì)胞表達(dá)desmin（結(jié)蛋白）明顯呈陽(yáng)性，5-Aza-CR誘導(dǎo)后14d表達(dá)myosin（肌動(dòng)蛋白重鏈）程度明顯呈陽(yáng)性。(9) BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定在傳3代干細(xì)胞中加入含BrdU40μg/ml標(biāo)記培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h，觀察可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，懸浮死亡細(xì)胞較少，進(jìn)一步鋪片以免疫組化法檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況，可見(jiàn)部分細(xì)胞核呈棕黃色，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。(10)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植將誘導(dǎo)后的干細(xì)胞用BrdU標(biāo)定，手術(shù)直視下移植入大鼠膀胱內(nèi)，4周后取出大鼠膀胱，以免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞在活體大鼠膀胱內(nèi)可繼續(xù)生存且分布均勻。 結(jié)論：(1)骨髓提取培養(yǎng)后得到的不是單一種類(lèi)細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞只占其中一小部分，需要人為施加影響因素，使其擴(kuò)增，純化，最終形成以干細(xì)胞為主的細(xì)胞群落。(2) MSCs生長(zhǎng)先慢后快再慢，呈典型的S型曲線，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)P4以?xún)?nèi)的MSCs適應(yīng)能力強(qiáng)，形態(tài)穩(wěn)定，代謝旺盛，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。(3)初次換液最佳時(shí)間為2-4小時(shí)，視具體情況而定，換液間隔一般為3-5天，傳代時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活掌握。(4)最適合MSCs生長(zhǎng)的環(huán)境為含10%胎牛血清和90%DMEM（L）的培養(yǎng)液，最適合MSCs向成肌細(xì)胞分化的環(huán)境為10%馬血清、90%DMEM（L）和10μmol/L5-Aza-CR構(gòu)成的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系。(5)誘導(dǎo)后干細(xì)胞desmin（結(jié)蛋白）、myosin（肌動(dòng)蛋白重鏈）均呈陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明5-Aza-CR誘導(dǎo)MSCs向成肌細(xì)胞分化成功。(6)經(jīng)鑒定，本實(shí)驗(yàn)提取的干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記抗原CD29，CD44呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34，CD45呈陰性表達(dá)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)體系中的主要細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，純度高，活性大，可以用于實(shí)驗(yàn)研究。(7)經(jīng)檢測(cè)，SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在移植入膀胱逼尿肌無(wú)力模型鼠后，可繼續(xù)存活于大鼠膀胱肌層內(nèi)，移植后連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)鼠3個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)有不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)：SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植安全、有效。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類(lèi)】：R329
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
材料與方法
結(jié)果
附圖
附表
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀
    參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉斌鈺;李寧毅;樊功為;金曉明;陳立強(qiáng);;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

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本文編號(hào)：2864298