發(fā)布時間：2020-10-30 05:16

　　 以Gen Bank中報道的單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)野生型菌株EGDe的nox基因(Gen Bank ID:986631)為研究對象,探討在高等動植物中普遍存在的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在Lm中是否也可以介導產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。首先通過誘導nox基因在BL21中表達產(chǎn)生Nox蛋白,利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot鑒定該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量;然后構(gòu)建過表達菌株EGDe-nox,測定ROS產(chǎn)生情況,并使用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應檢測nox基因的過表達對Lm毒力基因表達的影響。結(jié)果表明,經(jīng)鑒定Nox蛋白分子質(zhì)量約為33 k D,過表達菌株EGDe-nox與對照組EGDe的ROS產(chǎn)生量相比并無多大變化,nox基因的過表達會導致與侵襲相關(guān)的基因act A、inlA和inlB以及毒力基因prfA的表達上調(diào)。由此推測,該Nox蛋白不能獨立主導ROS的產(chǎn)量,但其過表達卻可以增強毒力基因表達上調(diào)。本研究為繼續(xù)探討細菌中Nox的作用提供一定的參考依據(jù)。
【部分圖文】：

?mL重懸菌液，靜置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h后添加1mL苯酚-乙醇（1∶9，V/V）4℃低溫混合液，冰上孵育30min。將樣品5000×g離心5min，收集沉淀菌體。將沉淀菌體用裂解液（包含50μL250U/mL的變?nèi)芫睾?0μL25mg/mL的溶菌酶）進行重懸，超聲溶解30min。采用Trizol法提取裂解液中的RNA。采用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以制得的cDNA作為模板進行qRT-PCR實驗。2結(jié)果與分析2.1nox基因的克隆與表達2.1.1EGDe中nox基因的鑒定結(jié)果700bp500bp400bpM12MM.DNAMarker；1、2.EGDe。圖1PCR鑒定EGDe中的nox基因結(jié)果Fig.1DetectionofnoxfromEGDebyPCR利用引物nox-F和nox-R對EGDe進行nox基因的擴增，結(jié)果如圖1所示，泳道1、2為EGDe的nox基因的擴增產(chǎn)物，從圖中可看到在633bp處皆有目的條帶出現(xiàn)，說明在EGDe中有nox基因序列存在。

※生物工程食品科學2017,Vol.38,No.02492.1.2重組載體T-nox的構(gòu)建結(jié)果鑒定700bp500bp400bpMA12345700bp500bp400bpMB6789M.DNAMarker；1～5.陽性克��；6～9.雙酶切結(jié)果。圖2重組載體T-nox的PCR（A）及雙酶切（B）鑒定結(jié)果Fig.2DetectionofrecombinantvectorT-noxbyPCR(A)andidentificationbydoublerestrictionenzymedigestion(B)利用引物nox-F和nox-R對陽性克隆進行PCR鑒定，結(jié)果如圖2A所示，得到如預期大�。�633bp）的PCR產(chǎn)物；圖2B顯示的是用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切之后的結(jié)果，上面的條帶是T載體，下面的條帶則是嵌合的基因nox。這兩種鑒定結(jié)果證明nox基因已正確和T載體連接，測序結(jié)果正確率達到99%以上，進一步證明連接正確。2.1.3重組載體pET30a-nox構(gòu)建結(jié)果鑒定500bpMA12345678910700bp500bp1000bp5000bp11MB1213M.DNAMarker；1～10.單菌落；11～12.對A圖的陽性克隆進行雙酶切鑒定；13.pET30a質(zhì)粒。圖3重組質(zhì)粒pET30a-nox的PCR（A）和雙酶切（B）鑒定結(jié)果Fig.3DetectionofrecombinantplasmidpET30a-noxbyPCR(A)andidentificationbydoublerestrictionenzymedigestion(B)重組質(zhì)粒pET30a-nox鑒定結(jié)果如圖3A、B所示，A圖是用引物nox-F和nox-R對10個單克隆進行PCR鑒定，泳道2、4、8在633bp處出現(xiàn)目的條帶，說明這3個單克隆為陽性克��；對陽性克隆進行XhoⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖B泳道11～22，在5000bp上一點各有一條帶為酶切后的pET30a質(zhì)粒條帶，原pET30a大小為5422bp，而在633bp處也各有一條帶，為酶切后的nox基因片段。重組質(zhì)粒pET30a-nox測序結(jié)果正確率99%以上，證明該質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.1.4pET30a-nox表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析M1234kD26kD17kD33kD25kDM.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量?

nenzymedigestion(B)利用引物nox-F和nox-R對陽性克隆進行PCR鑒定，結(jié)果如圖2A所示，得到如預期大�。�633bp）的PCR產(chǎn)物；圖2B顯示的是用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切之后的結(jié)果，上面的條帶是T載體，下面的條帶則是嵌合的基因nox。這兩種鑒定結(jié)果證明nox基因已正確和T載體連接，測序結(jié)果正確率達到99%以上，進一步證明連接正確。2.1.3重組載體pET30a-nox構(gòu)建結(jié)果鑒定500bpMA12345678910700bp500bp1000bp5000bp11MB1213M.DNAMarker；1～10.單菌落；11～12.對A圖的陽性克隆進行雙酶切鑒定；13.pET30a質(zhì)粒。圖3重組質(zhì)粒pET30a-nox的PCR（A）和雙酶切（B）鑒定結(jié)果Fig.3DetectionofrecombinantplasmidpET30a-noxbyPCR(A)andidentificationbydoublerestrictionenzymedigestion(B)重組質(zhì)粒pET30a-nox鑒定結(jié)果如圖3A、B所示，A圖是用引物nox-F和nox-R對10個單克隆進行PCR鑒定，泳道2、4、8在633bp處出現(xiàn)目的條帶，說明這3個單克隆為陽性克��；對陽性克隆進行XhoⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖B泳道11～22，在5000bp上一點各有一條帶為酶切后的pET30a質(zhì)粒條帶，原pET30a大小為5422bp，而在633bp處也各有一條帶，為酶切后的nox基因片段。重組質(zhì)粒pET30a-nox測序結(jié)果正確率99%以上，證明該質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.1.4pET30a-nox表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析M1234kD26kD17kD33kD25kDM.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.未誘導組；2.誘導組。圖4pET30a-nox表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.4SDS-PAGEanalysisofexpressionproductsofpET30a-nox將重組的pET30a-nox轉(zhuǎn)入表達型大腸桿菌BL21誘導表達，經(jīng)過蛋白電泳并染色脫色后的條帶結(jié)果如圖4所示。對誘導前泳道和誘導后泳道的對比發(fā)現(xiàn)，在25kD和33kD處的蛋白條帶均在誘導后出現(xiàn)了表達升高。泳道1為未誘
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