先天免疫系統(tǒng)是生物體中天然的抵御外界病原微生物入侵的防御機(jī)制,是宿主產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。炎癥小體作為一種由細(xì)胞胞漿內(nèi)先天免疫識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物,是細(xì)胞質(zhì)先天免疫系統(tǒng)的重要組成。目前炎癥小體在哺乳動(dòng)物中主要分為caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典炎癥小體和caspase-11(鼠)或者caspase-4/5(人)介導(dǎo)的非經(jīng)典炎癥小體。近期研究表明,非經(jīng)典炎癥小體caspase-4/5/11通過其CARD結(jié)構(gòu)域,可以識(shí)別胞內(nèi)革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS,又稱內(nèi)毒素),激活非經(jīng)典炎癥小體通路,導(dǎo)致細(xì)胞焦亡,并誘導(dǎo)IL-1β和IL-18等炎性細(xì)胞因子的成熟和分泌。該過程在拮抗和清除病原感染過程中具有重要意義,同時(shí),也在調(diào)控革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克效應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本課題組前期研究結(jié)果顯示,相對(duì)于野生型殺魚愛德華氏菌EIB202感染而言,溶血素過表達(dá)殺魚愛德華氏菌09901感染斑馬魚ZF4細(xì)胞后,能夠誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞焦亡效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上,鑒定出斑馬魚caspy2在識(shí)別細(xì)胞內(nèi)LPS過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此,本論文擬進(jìn)一步闡明斑馬魚caspy2介導(dǎo)的非經(jīng)典炎癥小體激活在宿主黏膜免疫過程中發(fā)揮的功能,并探索斑馬魚caspy2非經(jīng)典炎癥小體激活介導(dǎo)的內(nèi)毒素休克效應(yīng)的分子機(jī)制。首先,本論文考察了 caspy2在斑馬魚發(fā)育過程中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白從斑馬魚受精卵發(fā)育后48 h開始,出現(xiàn)了顯著的持續(xù)性表達(dá)。其次,采用斑馬魚幼魚整胚原位雜交技術(shù),發(fā)現(xiàn)在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中,caspy2主要在嘴、咽弓和腸道中具有顯著的表達(dá),暗示其可能在黏膜免疫過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能。然后,本論文采用嗎啉代反義寡核苷酸(Morpholino)顯微注射斑馬魚胚胎技術(shù),建立了 caspy2敲降斑馬魚幼魚活體模型。在此基礎(chǔ)上,本論文進(jìn)一步建立了 5 dpf斑馬魚幼魚浸泡感染殺魚愛德華氏菌模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于EIB202侵染而言,09091突變株侵染斑馬魚后,能夠檢測到顯著的caspy2激活現(xiàn)象。同時(shí),采用09091侵染野生型或caspy2敲降斑馬魚幼魚發(fā)現(xiàn),caspy2的敲降會(huì)導(dǎo)致幼魚死亡率顯著升高。并且,通過幼魚體內(nèi)細(xì)菌定殖檢測發(fā)現(xiàn),09091在caspy2敲降斑馬魚中的病原定殖能力顯著高于野生型斑馬魚。更有趣的是,通過斑馬魚活體顯微觀察發(fā)現(xiàn),09091感染caspy2敲降斑馬魚后,細(xì)菌能夠顯著突破腸道屏障,向背弓和肌肉組織中進(jìn)行擴(kuò)散感染。進(jìn)一步通過組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),在病原菌感染過程中,caspy2對(duì)于維持斑馬魚幼魚腸道的完整性具有重要作用。綜上所述,本論文結(jié)果闡明了斑馬魚caspy2非經(jīng)典炎癥小體激活在宿主黏膜免疫過程中發(fā)揮的至關(guān)重要的作用。其次,為了進(jìn)一步考察斑馬魚caspy2非經(jīng)典炎癥小體激活是否在內(nèi)毒素休克過程中發(fā)揮作用,本研究采用致死劑量LPS浸泡感染斑馬魚幼魚,建立了斑馬魚內(nèi)毒素休克模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于野生型斑馬魚幼魚而言,caspy2敲降斑馬魚幼魚的存活率顯著提高。同時(shí),在caspy2敲降斑馬魚感染組,由內(nèi)毒素休克效應(yīng)引起的心包水腫和組織糜爛的癥狀明顯弱于野生型斑馬魚感染組。并且,通過檢測IL-lβ、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-y等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn),caspy2的敲降能夠顯著降低細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生。因此,本論文進(jìn)一步闡明了斑馬魚caspy2非經(jīng)典炎癥小體在介導(dǎo)內(nèi)毒素休克效應(yīng)過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。綜上所述,本論文解析了斑馬魚caspy2非經(jīng)典炎癥小體激活在宿主抵御病原感染過程中發(fā)揮的重要功能。同時(shí),靶向敲降斑馬魚caspy2能夠有效減弱斑馬魚幼魚內(nèi)毒素休克效應(yīng)的發(fā)生。該研究成果為進(jìn)一步在活體水平上研究非經(jīng)典炎癥小體信號(hào)通路激活的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為臨床篩選治療內(nèi)毒素休克效應(yīng)的靶向藥物提供了一定的線索。
【學(xué)位單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

?華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文??形成的ＧＳＤＭＤ－Ｎ端促進(jìn)了細(xì)胞焦亡和ＮＬＰＲ３依賴的ｃａｓｐａｓｅ－１的蛋白水解（圖１．２）。??Ｓｈｉ等［２８］發(fā)現(xiàn)ＧＳＤＭＤ的敲除顯著減弱了?ＬＰＳ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡效應(yīng)和ＩＬ－１Ｐ的分泌，??并且ＧＳＤＭＤ并不影響ｃａｓｐａｓｅ－１１的激活和ＩＬ－ｉｐ的成熟，表明ＧＳＤＭＤ在ｃａｓｐａｓｅ－１??的下游，僅僅在ｃａｓｐａｓｅ－１１非經(jīng)典炎癥小體誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和ＩＬ－ｉｐ的分泌過程中發(fā)揮??了重要的作用（圖１．２ｈＡｇｌｉｅｔｔｉ等ｔ２９］發(fā)現(xiàn)ＧＳＤＭＤ－Ｎ端能夠在質(zhì)膜上形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的環(huán)??狀孔洞，且ＧＳＤＭＤ－Ｎ端的定位及其環(huán)狀結(jié)構(gòu)僅可見于ＬＰＳ誘導(dǎo)激活ｃａｓｐａｓｅ－１１的巨噬??細(xì)胞中。巨噬細(xì)胞中完整的ＧＳＤＭＤ沒有生物學(xué)活性，激活的ｃａｓｐａｓｅ－１１可以切割其Ｎ??端和Ｃ端的連接結(jié)構(gòu)，使之形成獨(dú)立的Ｎ端和Ｃ端蛋白，從而解除了?ＧＳＤＭＤ－Ｎ端蛋??白固有的打孔活性的自抑制狀態(tài)［２］。具有打孔活性的ＧＳＤＭＤ－Ｎ端蛋白轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，??與膜結(jié)構(gòu)結(jié)合并形成１０？１４?ｎｍ直徑的孔洞

??１．３模式生物斑馬魚??１．３．１斑馬魚作為感染免疫互作模型??斑馬魚是近年來研究熱門的明星模式動(dòng)物，其具有一系列的優(yōu)點(diǎn)：（１）易于存活和??培養(yǎng)；（２）體外受精，胚胎發(fā)育外顯；（３）生命早期的光學(xué)透明性，易于觀察；（４）易于??敲除和敲進(jìn)的基因遺傳學(xué)；（５）具有脊椎動(dòng)物的生理學(xué)功能；（６）斑馬魚具有較強(qiáng)的繁??殖力，能夠提供大量的實(shí)驗(yàn)樣本；（７）與哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚的免疫系統(tǒng)具有良好的??保守性；（８）斑馬魚中的類似髓樣細(xì)胞衍生的免疫細(xì)胞均己被鑒定［４２］，包括單核細(xì)胞、??巨噬細(xì)胞（Ｍｌ和Ｍ２亞型）、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和與ＮＫ細(xì)胞相似??的殺傷性細(xì)胞。其造血發(fā)生在斑馬魚發(fā)育的２２?ｈｐｆ。到４８?ｈｐｆ，胚胎具有了完整功能的??巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，它們能夠識(shí)別并響應(yīng)入侵的細(xì)菌病原菌。發(fā)育到約３?ｄｐｆ時(shí)，??胚胎會(huì)從胚膜孵化出來，同時(shí)腸道微生物開始定殖。此時(shí)，幼魚中會(huì)出現(xiàn)Ｂ細(xì)胞和Ｔ??細(xì)胞前體Ｒａｇ依賴的重組，但是其適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在幼魚約４周齡時(shí)才發(fā)揮功能。圖??１．３顯示了斑馬魚幼魚時(shí)期免疫系統(tǒng)發(fā)育的各個(gè)重要時(shí)間點(diǎn)。??

?第１３頁??的非經(jīng)典炎癥小體激活過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用（圖１．４）。??Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ?Ｃａｓｐｙ２?ＫＯ?Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ?Ｃａｓｐｙ２?ＫＯ?ＷＭ－ｔｙｐｅ?Ｃａｓｐｙ２?ＫＯ??圣?４１?４１?６０－｜?＊?６０－１?ｃ７?＾??｜?＊?一土?－ｐｒｏ－ｃａｓｐｙ２??ｉｆ?ｉ?：?ｒ°?ｉ４０?；ｆ?．?，Ｐ２〇??Ｉ?ｉｎｉ?ｉｌｉｉ１２０遍＿２?ｊａｉｌ??一??圖１．４?Ｃａｓｐｙ２介導(dǎo)胞內(nèi)ＬＰＳ誘導(dǎo)的非經(jīng)典炎癥小體的激活??Ｆｉｇ．?１．４?Ｃａｓｐｙ２?ｇａｔｅｓ?ｔｈｅ?ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ＬＰＳ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ?ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．??通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，和哺乳動(dòng)物非經(jīng)典炎癥小體激活具有一定的相似性和差異性，??ｃａｓｐｙ２的Ｐｙｒｉｎ結(jié)構(gòu)域能夠與胞內(nèi)ＬＰＳ直接結(jié)合，引起ｃａｓｐｙ２寡聚化，然后激活斑馬魚??非經(jīng)典炎癥小體
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本文編號(hào)：2860158