目的:首先在ICR小鼠上建立48/80和CQ誘導(dǎo)的急性瘙癢模型和包括銀屑病樣以及干皮病樣慢性瘙癢模型,再給予褪黑素(melatonin)處理,采用藥理學(xué)、行為學(xué)方法、流式細(xì)胞技術(shù)、分子細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù),來研究褪黑素抑制急性瘙癢和慢性瘙癢的分子機(jī)制。方法:(1)將成年ICR小鼠進(jìn)行晝夜節(jié)律實(shí)驗(yàn),早八點(diǎn)至晚八點(diǎn)正常光照,晚八點(diǎn)至早八點(diǎn)完全避光。兩周后,再隨機(jī)分成五組分別是對照組(Vehicle組),銀屑病組(PSO組),銀屑病+褪黑素組(PSO+Melatonin組),干皮病組(AEW組),干皮病+褪黑素組(AEW+Melatonin組)。造模一周后,早晨六點(diǎn)眼眶取血,每隔六小時取一次,至第二天早六點(diǎn)。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測血液中褪黑素的含量。(2)將成年雄性ICR小鼠在頸部注射100ug的48/80以及200ug CQ,通過三種不同給藥方式分別是皮內(nèi)混合注射,腹腔注射,鞘內(nèi)注射不同劑量的褪黑素,觀察并定量分析小鼠的瘙癢行為。3)將ICR成年雄性小鼠隨機(jī)分成三組,一組僅做脫毛處理,不涂抹藥物(Vehicle組),一組涂抹咪喹莫特乳膏(PSO組),最后一組涂抹咪喹莫特乳膏,并在第三天,第五天,第七天涂抹咪喹莫特乳膏前腹腔注射褪黑素(PSO+Melatonin組),每組5-9只。應(yīng)用行為學(xué)方法,HE染色技術(shù),檢測褪黑素是否能緩解銀屑病樣瘙癢,小鼠角質(zhì)細(xì)胞增殖情況。(4)將ICR成年雄性小鼠隨機(jī)分成三組,一組僅做脫毛處理,不涂抹藥物(Vehicle組),一組先涂抹丙酮和乙醚1:1,30秒,再涂抹水15秒(AEW組),一天兩次,最后一組涂抹咪丙酮和乙醚1:1,30秒,再涂抹水15秒,并在第三天,第五天,第七天涂抹丙酮、乙醚和水前腹腔注射褪黑素(AEW+Melatonin組),每組5-9只。應(yīng)用行為學(xué)方法,HE染色技術(shù),檢測褪黑素是否能緩解干皮病樣瘙癢,小鼠角質(zhì)細(xì)胞增殖情況。(5)應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù),檢測兩種慢性瘙癢模型及褪黑素處理后炎癥因子和受體的mRNA表達(dá)情況。(6)采用藥理學(xué)的方法,將48/80和CQ分別與褪黑素以及褪黑素受體的拮抗劑4-4PDOT和Luzindole,混合皮內(nèi)注射小鼠頸部,運(yùn)用行為學(xué)的方法檢測小鼠的搔抓行為。在銀屑病和干皮病兩種慢性瘙癢模型中,第三天,第五天,第七天處理褪黑素前半個小時腹腔注射EX527,運(yùn)用行為學(xué)的方法檢測小鼠的搔抓行為,看能否反轉(zhuǎn)褪黑素抑制慢性瘙癢。(7)將ICR小鼠隨機(jī)分組,分成對照組,銀屑病組,銀屑病加褪黑素組,干皮病組,干皮病加褪黑素組,造模七天后,取小鼠皮膚,頸膨大脊髓和皮膚組織,并應(yīng)用蛋白免疫印跡檢測p-AKT,p-ERK表達(dá)情況,確定褪黑素抑制慢性瘙癢和p-AKT,p-ERK之間的關(guān)系。結(jié)果:(1)在晝夜節(jié)律實(shí)驗(yàn)中,對照組小鼠褪黑素節(jié)律正常,銀屑病和干皮病小鼠模型中褪黑素含量節(jié)律失調(diào),褪黑素處理后褪黑素含量升高。(2)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,在小鼠急性癢模型中,褪黑素以皮內(nèi),腹腔,鞘內(nèi)三種給藥方式,均能抑制48/80和CQ誘發(fā)的瘙癢。(3)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在銀屑病和干皮病兩種慢性瘙癢模型中,分別在第三天,第五天,第七天腹腔注射褪黑素,結(jié)果顯示,褪黑素可以抑制慢性瘙癢。(4)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,慢性瘙癢模型中,炎癥因子顯著升高,在銀屑病模型中,褪黑素可以抑制IL33,ST2表達(dá)。干皮病模型中,褪黑素可以抑制IL31,IL31RA表達(dá)。(5)在ND7-23細(xì)胞上,通過流式檢測結(jié)果顯示,褪黑素可以抑制48/80和CQ誘發(fā)的ROS,并且在銀屑病模型上,抗氧化基因Sod2有明顯降低,給褪黑素后能夠反轉(zhuǎn)其表達(dá)。(6)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在小鼠急性癢模型中,褪黑素受體拮抗劑4-4PDOT,Luzindole能夠反轉(zhuǎn)褪黑素抑制48/80和CQ誘發(fā)的瘙癢。(7)Western blotting結(jié)果顯示,褪黑素抑制銀屑病皮膚上p-AKT的表達(dá),可以緩解干皮病脊髓上p-ERK表達(dá)。結(jié)論:(1)慢性瘙癢小鼠模型褪黑素晝夜節(jié)律失調(diào)。(2)褪黑素可以抑制小鼠急性癢和慢性瘙癢。(3)抗氧化應(yīng)激和抗炎癥在褪黑素抑制誘急性瘙癢和慢性瘙癢中發(fā)揮重要作用。(4)P-AKT和p-ERK在褪黑素抑制慢性瘙癢中發(fā)揮作用。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R338.3
【部分圖文】：

AEW+melatoninAEWVehicle 圖 4 腹腔注射褪黑素能緩解銀屑病樣和干皮病樣皮膚病理(A）銀屑病小鼠皮膚組織 HE 染色，藍(lán)色為細(xì)胞核皮膚厚度統(tǒng)計(jì)圖(n=10-15;***P<0.001 vs Vehicle;###P<0

圖 5 慢性瘙癢動物模型褪黑素晝夜節(jié)律失調(diào)(A)對照組褪黑素晝夜節(jié)律明顯，銀屑病組和干皮病組褪黑素晝夜節(jié)律失調(diào)(n=3; *P<0.05 vs Vehicle，未配對 t 檢驗(yàn)；所有數(shù)據(jù)均用 Mean ± SEM 表示)。(B) 銀屑病+褪黑素組小鼠血液褪黑素含量升高 (n=3;*P<0.05 vs PSO，未配對 t 檢驗(yàn)；所

圖 7 褪黑素抑制急性瘙癢與緩解氧化應(yīng)激有關(guān)（A,B）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量示意圖。峰值右移說明胞內(nèi) ROS產(chǎn)生量升高，左移表明 ROS 含量減少。（C,D） 胞內(nèi) ROS 含量的統(tǒng)計(jì)圖。48/80和 CQ 能夠顯著增加胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生，同時褪黑素可以顯著降低 48/80 和 CQ 誘
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本文編號：2860152