銅綠假單胞菌是一種環(huán)境中廣泛分布的條件致病菌,因抗生素濫用,該菌已成為最嚴(yán)重耐藥菌之一。銅綠假單胞菌較強(qiáng)的生物被膜形成能力是其產(chǎn)生耐藥性的重要原因,目前急需尋找新方法來(lái)解決銅綠假單胞菌耐藥性問(wèn)題。噬菌體因其能特異性感染并裂解宿主菌,和安全、高效、研發(fā)周期短的特點(diǎn)得到了研究者們的重視。本研究以多重耐藥性銅綠假單胞菌為宿主,篩選其裂解性噬菌體并考察其中一株噬菌體對(duì)多重耐藥性銅綠假單胞菌生物被膜的防控效果。主要工作內(nèi)容如下:(1)以多重耐藥性銅綠假單胞菌為宿主,分離獲得三株銅綠假單胞菌裂解性噬菌體分別命名為G1,LS1和C1,透射電鏡觀察三株噬菌體都為有尾目噬菌體,G1和LS1屬于肌尾科噬菌體,C1屬于長(zhǎng)尾科噬菌體;噬菌體G1潛伏期為20 min,裂解量為230PFU/infected cell,噬菌體LS1和C1的潛伏期約30 min,裂解量分別為77 PFU/infected cell和86 PFU/infected cell;噬菌體G1的pH耐受性范圍較寬,為4.0~11.0,LS1在pH值耐受范圍為5.0~9.0,C1的pH值耐受范圍為6.0~10.0;(2)全基因組測(cè)序結(jié)果顯示三株噬菌體基因組均為雙鏈線性DNA,噬菌體G1基因組大小為87,646 bp,G+C含量為54.7%,有156個(gè)基因,其中26個(gè)為已知功能基因,含有3個(gè)tRNA基因;噬菌體LS1基因組大小為66,093 bp,G+C含量為55.7%,有92個(gè)基因,其中35個(gè)為已知功能基因;噬菌體C1基因組大小為43,133 bp,G+C含量為53.6%,有59個(gè)基因,其中27個(gè)為已知功能基因;三株噬菌體都未發(fā)現(xiàn)整合酶,毒力因子和抗生素抗性基因;(3)根據(jù)噬菌體的宿主譜分析,首先考察噬菌體LS1的生物被膜防控能力。為考察噬菌體LS1對(duì)多重耐藥性銅綠假單胞菌生物被膜的作用效果,分別用結(jié)晶紫染色、活菌計(jì)數(shù)和掃描電子顯微鏡法評(píng)價(jià)噬菌體的作用效果�；罹�(jì)數(shù)結(jié)果顯示,噬菌體LS1可以抑制99%的銅綠假單胞菌生物被膜菌生長(zhǎng),能夠清除85%的生物被膜菌;掃描顯微鏡觀察結(jié)果同樣顯示噬菌體LS1能清除已形成的銅綠假單胞菌生物被膜;生物被膜菌對(duì)噬菌體抗性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,噬菌體與生物被膜菌相互作用時(shí),在24 h時(shí)會(huì)出現(xiàn)對(duì)噬菌體LS1抗性菌株。
【學(xué)位單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R378
【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 銅綠假單胞菌簡(jiǎn)介
        1.1.1 銅綠假單胞菌生物學(xué)特性和致病性
        1.1.2 銅綠假單胞菌的耐藥性
    1.2 細(xì)菌生物被膜
        1.2.1 生物被膜的概念和構(gòu)成
        1.2.2 生物被膜的生物學(xué)意義及其危害
        1.2.3 生物被膜的破除方法
    1.3 噬菌體去除生物被膜理論
        1.3.1 噬菌體簡(jiǎn)介
        1.3.2 目前噬菌體裂解細(xì)菌生物被膜理論
    1.4 噬菌體去除生物被膜的應(yīng)用研究
        1.4.1 噬菌體去除臨床病原菌生物被膜的研究
        1.4.2 防控食品工業(yè)生產(chǎn)中生物被膜的研究
        1.4.3 噬菌體清除污水處理廠濾膜生物淤積的研究
    1.5 本論文研究意義
    1.6 本論文研究思路
2 銅綠假單胞菌噬菌體的分離和生物學(xué)特性研究
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)用品
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種
        2.2.2 引物合成
        2.2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.5 實(shí)驗(yàn)溶液的配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 銅綠假單胞菌的分子生物學(xué)鑒定
        2.3.2 噬菌體的分離純化
        2.3.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定
        2.3.4 噬菌體宿主譜分析
        2.3.5 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線及裂解量測(cè)定
        2.3.6 噬菌體溫度和pH穩(wěn)定性測(cè)定
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 銅綠假單胞菌的分子生物學(xué)鑒定
        2.4.2 噬菌體分離純化
        2.4.3 噬菌體透射電鏡觀察
        2.4.4 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定
        2.4.5 噬菌體宿主譜分析
        2.4.6 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線及裂解量測(cè)定
        2.4.7 噬菌體溫度和pH穩(wěn)定性測(cè)定
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
3 銅綠假單胞菌噬菌體基因組學(xué)研究
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        3.2.2 分析軟件
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 噬菌體基因組核酸的提取和測(cè)序
        3.3.2 噬菌體基因組基因預(yù)測(cè)及功能注釋
        3.3.3 噬菌體的進(jìn)化關(guān)系與基因組共線性分析
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 噬菌體基因組的提取和測(cè)序
        3.4.2 噬菌體基因組基因預(yù)測(cè)與功能注釋
        3.4.3 噬菌體的進(jìn)化關(guān)系與基因組共線性分析
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
4 噬菌體LS1對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌生物被膜的作用研究
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器與溶液配制
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 銅綠假單胞菌生物被膜形成周期測(cè)定
        4.3.2 不同銅綠假單胞菌株生物被膜形成能力測(cè)定
        4.3.3 噬菌體LS1對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜作用研究
        4.3.4 生物被膜菌對(duì)噬菌體抗性評(píng)價(jià)
        4.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 銅綠假單胞菌生物被膜形成周期
        4.4.2 銅綠假單胞菌生物被膜形成能力研究
        4.4.3 噬菌體對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜作用研究
        4.4.4 生物被膜菌對(duì)噬菌體抗性評(píng)價(jià)
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
結(jié)論
展望
參考文獻(xiàn)
附錄A 噬菌體G1基因組注釋結(jié)果
附錄B 噬菌體LS1基因組注釋結(jié)果
附錄C 噬菌體C1基因組注釋結(jié)果
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文和申請(qǐng)專(zhuān)利申請(qǐng)情況
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2859412