柯薩奇病毒A組16型(Coxackievirustype A 16,CA16)是腸道病毒屬小RNA病毒科的一員,CA16與腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(Hand Foot and Mouth Disease,HFMD)的主要病原體。隨著EV71預(yù)防性疫苗的上市使用,CA16無疑成為了引起HFMD的另一重要病原體。然而,由于CA16的發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)的免疫反應(yīng)尚不清楚,CA]6疫苗的開發(fā)工作面臨著諸多困難。先前的研究已經(jīng)表明呼吸道黏膜上皮細(xì)胞及其相關(guān)的免疫細(xì)胞,尤其是固有淋巴細(xì)胞(Innate lymphoid cells,ILCs),在很大程度上促進(jìn)了病毒感染過程中固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的激活。而ILCs是否在CA16感染引起的免疫反應(yīng)中發(fā)揮類似的作用目前尚未可知。在本研究中,為了揭示ILCs在CA16感染中的作用,我們首先用CA16感染體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE,并對其在感染16HBE細(xì)胞過程中與ILCs激活相關(guān)的多個信號通路分子的基因表達(dá)水平做了 Q-RT-PCR檢測。結(jié)果顯示了 CA16感染16HBE細(xì)胞時干擾素-腫瘤壞死因子家族信號分子的上調(diào)特征。隨后我們使用以油/水乳劑型乳劑配制的CA16滅活抗原與小鼠支氣管上皮細(xì)胞CP-M175共孵育,并繼續(xù)觀察導(dǎo)入CA16抗原后該細(xì)胞中天然免疫信號分子的表達(dá)變化情況,結(jié)果顯示以干擾素-腫瘤壞死因子家族為中心的信號反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的變化趨勢與該病毒感染16HBE細(xì)胞類似。進(jìn)一步的,我們利用這種CA16滅活疫苗通過鼻腔滴入免疫Balb/c小鼠,并分析了在呼吸道黏膜組織中ILCs與病毒抗原之間的相互關(guān)系。CA16活病毒和滅活的病毒顆粒在體內(nèi)和體外都能誘導(dǎo)ILCs活化所需要的各種信號通路分子的上調(diào)表達(dá)。此外,免疫熒光和共聚焦的觀察結(jié)果還發(fā)現(xiàn)病毒抗原與表達(dá)GATA-3/NKp46的ILC1和表達(dá)RORγt/GATA-3的ILC3存在共定位現(xiàn)象,而表達(dá)KLRG-1/GATA-3的ILC2卻沒有檢測到。與此同時,我們還觀察到了 CA16抗原和CD 11 c+DCs的共定位現(xiàn)象。隨后,我們檢測了不同免疫途徑的小鼠體內(nèi)抗CA16中和抗體和特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。所有的結(jié)果都提示以特別配制的CA16滅活疫苗通過鼻腔途徑免疫小鼠后能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的抗病毒免疫應(yīng)答。在本文的工作中,我們首先在體外組織培養(yǎng)體系中驗(yàn)證了 CA16與ILCs的相互作用關(guān)系。同時,通過利用Balb/c小鼠模型,我們進(jìn)一步分析了 CA16抗原經(jīng)鼻腔免疫動物后,其在體內(nèi)與ILCs的相互關(guān)系,以及由此誘發(fā)的機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的過程。本文的工作為進(jìn)一步探索基于病毒感染模型而設(shè)計(jì)相應(yīng)疫苗免疫模式的可能提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖３：天然淋巴細(xì)胞在屏障表面的保護(hù)作用［４７］??內(nèi)的抗病毒免疫應(yīng)答不僅受ＤＣ細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，Ｔ細(xì)胞和Ｂ細(xì)胞的受其他細(xì)胞的調(diào)節(jié)，如ＮＫ細(xì)胞和ＮＫＴ細(xì)胞。因此，充分了解體內(nèi)免的相互作用對于了解體內(nèi)抗病毒免疫應(yīng)答是很重要的。對于抗病毒免

將病毒液收獲后儲存于－８０°Ｃ，進(jìn)行病毒感染性滴度的測定。結(jié)果表明，隨著時間的??增加，１６ＨＢＥ細(xì)胞形態(tài)逐漸腫脹變圓，細(xì)胞間隙逐漸增大，２４ｈ時約有５０％的細(xì)胞??出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，４８ｈ時已有接近１００％的細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞病變效應(yīng)，如圖１所示。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?８ｈ?１６ｈ??■｜｜?ＩＩ?｜??２４ｈ?３２ｈ?４８ｈ??■■■■■?■■■■?■■■■ｉ??圖１：人呼吸道上皮細(xì)胞１６ＨＢＥ感染ＣＡ１６病毒后細(xì)胞形態(tài)的變化。??２．１．２?ＣＡ１６感染１６ＨＢＥ細(xì)胞后增殖動力學(xué)檢測??以ＭＯＩ＝０．１的ＣＡ１６病毒液感染１６ＨＢＥ細(xì)胞后在３７°Ｃ下培養(yǎng)的條件下，在感??染后８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、３２ｈ、４０ｈ以及４８ｈ收取病毒樣品，采用５０％終點(diǎn)測定法測定??各個時間點(diǎn)的病毒滴度，并繪制增殖動力學(xué)曲線。從繪制出來的增殖曲線可以看出??２７??

?當(dāng)ＣＡ１６病毒感染１６ＨＢＥ細(xì)胞２４小時到３２小時之間時滴度達(dá)到峰值，而隨著時間??的增加病毒液滴度開始降低，如圖２所示。??曹?６．５?■??卜一??５．５?■??二??＾?５．０?Ｊ——，——，——，——，——，——．??０?８?１６?２４?３２?４０?４８??Ｈｏｕｒｓ?ｐｏｓｔ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ??圖２：?ＣＡ１６病毒在１６ＨＢＥ細(xì)胞上的增殖動力學(xué)曲線。??２．１．３?ＣＡ１６感染１６ＨＢＥ細(xì)胞后ＩＬＣｓ激活相關(guān)的信號通路分子變化??模式識別受體（ＰＲＲ）主要表達(dá)于固有免疫細(xì)胞表面，可以識別一種或多種??ＰＡＭＰ?（病原體相關(guān)分子模式）／ＤＡＭＰ?（損傷相關(guān)分子模式）。根據(jù)ＰＲＲ的功能可??以把ＰＲＲ主要分為可溶型ＰＲＲ，細(xì)胞吞噬型ＰＲＲ和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)型ＰＲＲ。信號傳導(dǎo)型??ＰＲＲ通過與ＰＡＭＰ／ＤＡＭＰ結(jié)合后
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2859362