發(fā)布時(shí)間：2020-10-27 12:08

　　 PD-1分子屬免疫球蛋白超家族成員,人PD-1分子為含有288個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白。PD-1主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞等。PD-1與其配體PD-L1、PD-L2相結(jié)合,發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用,參與維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。PD-1/PD-Ls免疫調(diào)節(jié)功能異常參與了自身免疫疾病和腫瘤等的重要病理機(jī)制。本文主要研制鼠抗人PD-1單克隆抗體,對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定,以期為PD-1/PD-Ls途徑的研究提供研究工具和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分構(gòu)建人PD-1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株目的:構(gòu)建人PD-1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,以用于PD-1單克隆抗體的研制。方法:將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體p EGZ-term-R/PD-1以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集具有感染能力的病毒上清,感染L929細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后,采用流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot方法鑒定該細(xì)胞株P(guān)D-1分子的表達(dá)。結(jié)果:獲得一株穩(wěn)定表達(dá)人PD-1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/PD-1。結(jié)論:成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人PD-1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,為研制PD-1單克隆抗體提供免疫原。第二部分鼠抗人PD-1單克隆抗體制備及鑒定目的:研制PD-1單克隆抗體為探討PD-1/PD-Ls途徑建立研究工具。方法:采用穩(wěn)定表達(dá)人PD-1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/PD-1,免疫BALB/c小鼠,采用常規(guī)B淋巴雜交瘤技術(shù),經(jīng)HAT培養(yǎng)篩選、間接免疫熒光分析,獲得一株持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株15D9;采用快速定性試紙法鑒定單克隆抗體類型;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)競爭結(jié)合位點(diǎn)、抗體效價(jià);采用細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定15D9對(duì)PD-1分子的識(shí)別。結(jié)果:獲得一株穩(wěn)定分泌抗人PD-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為15D9;15D9重鏈為Ig G1,輕鏈為κ鏈;競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單抗15D9與單抗6E1識(shí)別相似位點(diǎn);抗體效價(jià)結(jié)果顯示,0.3μg/test可用于間標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),1μg/test可用于直標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè);細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,15D9可特異性識(shí)別PD-1分子。結(jié)論:成功獲得一株穩(wěn)定分泌抗人PD-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株15D9,可用于免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化實(shí)驗(yàn)。第三部分鼠抗人PD-1單克隆抗體的阻斷功能鑒定目的:通過觀察單抗15D9在PBMC活化過程中的作用,初步鑒定單抗15D9的生物學(xué)功能。方法:采用激發(fā)型CD3單克隆抗體包被,聯(lián)合激發(fā)型CD28單克隆抗體活化PBMC,于24 h、48 h、72 h檢測(cè)PD-1和PD-L1分子的表達(dá)。加入單抗15D9后,觀察PBMC的形態(tài)變化,細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)PBMC數(shù)量變化。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD69、CD25在24 h、48 h和72 h的表達(dá)水平。采用ELISA檢測(cè)在96 h時(shí)IL-2和IFN-γ的分泌量。結(jié)果:激發(fā)型CD3單克隆抗體聯(lián)合激發(fā)型CD28單克隆抗體活化PBMC后,PBMC表達(dá)PD-1和PD-L1分子。加入單抗15D9后,CD3+CD28+15D9組與CD3+CD28+Ig G組相比,PBMC集落直徑增大、集落數(shù)量增多,PBMC的CD69、CD25表達(dá)增高,分泌的IFN-γ升高。結(jié)論:激發(fā)型CD3單克隆抗體聯(lián)合激發(fā)型CD28單克隆抗體可活化PBMC,加入單抗15D9后PBMC活化程度增強(qiáng),表明15D9是一株具有阻斷功能的單克隆抗體。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 1 B7-CD28 家族共抑制信號(hào)(引自 Immunity, 2016, 44(5): 955-972)分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)譜 B7-DC 或 CD273，Tseng 和同事于 2002 年從 DC的基因文庫中鑒定了 B7-DC。小鼠 PD-L2（mPD-L 247 個(gè)氨基酸的前體蛋白，具有 23 個(gè) 氨基酸的 NmB7-DC 與人 B7-DC（hB7-DC）具有 70％的同源處在于它具有較長的胞質(zhì)尾巴。hPD-L2 基因位于 9，但細(xì)胞質(zhì)區(qū)較短。采用同源性檢索的方法，發(fā)現(xiàn)性（34％同一性，48％相似性）[21]。達(dá)譜較 PD-L1 窄，僅表達(dá)于 DCs 以及活化的巨噬細(xì)和培養(yǎng)的骨髓來源的肥大細(xì)胞[21-22]。在與 PD-1 結(jié)

圖 2 腫瘤微環(huán)境中免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)途徑(引自 Nat Immunol. 2013, 14(10): 1014–1022)PD-L1、PD-L2 途徑與腫瘤免疫治療常涉及多種抵抗機(jī)制，可以逃逸宿主腫瘤免疫系統(tǒng)免疫卡控點(diǎn)抑制劑顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫性。免疫卡控cular）是免疫系統(tǒng)中的多種激活和抑制途徑，其對(duì)維理學(xué)免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間和幅度至關(guān)重要。CTLA-4從而引發(fā)免疫應(yīng)答，是第一個(gè)經(jīng)臨床驗(yàn)證的免疫卡控的相互作用可以增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)，延緩腫瘤生長，并卡控點(diǎn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞破壞是癌癥免疫治療的重要策和 Pembrolizumab 分別是人的和完全人源化的 IgG4 P斷 PD-1 并通過消除 PD-1 介導(dǎo)的 T 細(xì)胞抑制來促進(jìn)

圖 2 Western Blot 鑒定 L929/PD-1 細(xì)胞 PD-1 的表達(dá)2：抗原為 L929 細(xì)胞裂解蛋白；3：抗原為 L929/M胞裂解蛋白討 論徑在機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。PD-1 與配遞負(fù)信號(hào)，其負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌并促進(jìn) T染細(xì)胞株可應(yīng)用于 PD-1 生物學(xué)功能研究，也開展 PD-1/PD-Ls 途徑的研究工作提供研究工具立了人 PD-1 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 L929/PD-1。首先-Term-R重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以及輔助病毒p轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞。為了提高轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染過素，包括轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長狀態(tài)、DNA 復(fù)合物與
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 駱群;呂明;于鳴;黎燕;;抗CD28抗體協(xié)同刺激增強(qiáng)抗CD3抗體體外激活T淋巴細(xì)胞并降低TGF-β的表達(dá)[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2006年03期

本文編號(hào)：2858503