鑒于纖維化疾病病人組織中Ⅰ型膠原的異常沉積和人胎盤生長因子2氨基酸123～144肽段(PlGF-2_(123-144))對Ⅰ型膠原蛋白出眾的高親性,嘗試制備PlGF-2_(123-144)短肽用于改善抗纖維化藥物的組織靶向特異性。首先對該短肽的編碼DNA序列進行修改和擴增,構(gòu)建了GST-PlGF-2_(123-144)融合蛋白的原核表達質(zhì)粒;進而使用E.coli BL21誘導(dǎo)表達該融合蛋白,并以谷胱甘肽瓊脂糖純化后透析;最后采用ELISA檢測確定,經(jīng)原核表達和純化所獲得的GST-PlGF-2_(123-14)融合蛋白具備對Ⅰ型膠原蛋白的高親性。為研發(fā)特異性靶向纖維化組織的抗纖維化藥物打下了可靠基礎(chǔ)。
【部分圖文】：

液進行透析并以BCA方法定量。1．2．4融合蛋白對I型膠原蛋白的親和活性的ELISA實驗測定按照圖1所示流程進行ELISA實驗。ELISA孔板首先用100μLI型膠原蛋白包埋4℃過夜、干燥過夜，隨后脫脂牛奶進行封閉。孔板漂洗后再分別加入GST融合蛋白和膠原蛋白共孵育。漂洗后加入GST一抗(1∶5000)4℃孵育過夜檢測滯留的GST蛋白。二抗孵育后，加入0.3%H2O2甲醇溶液封閉、進行常規(guī)顯色。讀取各孔450nm處OD值并計算GST信號。圖1ELISA實驗流程示意圖Figure1ELISAexperimentalflowdiagram1．2．5統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(x±s)表示。采用TTEST檢驗方法比較同等摩爾數(shù)的GST和GST-PlGF－2123－144蛋白的組間差異，P＜0.05表示組間有顯著性差異。2結(jié)果與分析2.1PlGF－2123－144基因片段的獲得采用各含部分PlGF－2123－144DNA序列的兩段引物進行退火和PCＲ擴增，獲得含PlGF－2123－144序列的擴增產(chǎn)物(圖2－A);隨后與pMD19－T載體連接，轉(zhuǎn)化E．coliDH5α感受態(tài)細胞。挑選白色菌落進行菌落PCＲ，2%瓊脂糖凝膠電泳顯示100bp處有一條特異性條帶，與PlGF－2123－144(88bp)片段大小基本相符(圖2－B)。提取陽性細菌質(zhì)粒，使用HindⅢ進行單酶切。圖2－C的0.8%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，1泳道1.9kb的未線性化質(zhì)粒在單酶切后產(chǎn)生約2.7kb的片段，和pMD19－PlGF－2123－1442770bp的大小符合(2號泳道)。測序結(jié)果顯示PlGF－2123－144目的DNA序列成功克隆到pMD19質(zhì)粒(圖2－D)

?ń峁?EcoＲI單酶切產(chǎn)生的約5kb單一片段在結(jié)合EcoＲV進行雙酶切后，可被斷裂為2和3kb大小的兩個片段，表明兩種pGEX4T1質(zhì)粒均被成功導(dǎo)入E．coliBL21。A:PlGF－2123－144序列的PCＲ擴增;B:pMD19－PlGF－2123－144菌落PCＲ;C:pMD19－PlGF－2123－144質(zhì)粒單酶切;D:pMD19－PlGF－2123－144測序圖2pMD19－PlGF－2123－144質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定Figure2ConstructionandcharacterizationofpMD19－PlGF－2123－144plasmidA:菌落PCＲ;B:測序結(jié)果;C:pGEX－4T－1轉(zhuǎn)化BL21酶切結(jié)果;D:pGEX4T1－PlGF－2123－144轉(zhuǎn)化BL21酶切鑒定結(jié)果圖3重組質(zhì)粒pGEX4T1－PlGF－2123－144質(zhì)粒鑒定和轉(zhuǎn)化BL21鑒定結(jié)果Figure3IdentificationandtransformationofBL21byrecombinantplasmidpGEX4T1－PlGF－2123－1442.3GST和GST-PlGF－2123－144蛋白的誘導(dǎo)表達以30℃為誘導(dǎo)溫度，探索IPTG誘導(dǎo)濃度(0.1～4mmol/L)和誘導(dǎo)時間(1～4h)對兩種GST蛋白誘導(dǎo)表達的影響。如圖4－A所示，1mmol/LIPTG誘導(dǎo)6h后，GST的蛋白產(chǎn)量和在細菌裂解上清中的所占比例都已達到較好水平。圖4－B的WesternBlot分析結(jié)果則顯示了GST-PlGF－2123－144蛋白在不同條件下都有較好的誘導(dǎo)表達。進一步對目的蛋白陽性條帶進行光密度掃描定量分析，發(fā)現(xiàn)1mmol/LIPTG時，不同誘導(dǎo)時間樣品的光密度分別為3734.95、5358.32、7231.04和7681.65，說明蛋白產(chǎn)量隨誘導(dǎo)時間延長而增多。當(dāng)設(shè)定誘導(dǎo)時間6h，不同IPTG濃度下樣品的光密度分別為8895.96、7990.42、7681.65、6246.76和8078.7

l/LIPTG和6h的誘導(dǎo)條件下，可溶性GST-PlGF－2123－144蛋白產(chǎn)量可達最高。通過對細菌總蛋白進行考馬斯亮藍染色，我們比較了GST和GST-PlGF－2123－144融合蛋白表達產(chǎn)量。圖5－B為來自相同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件(1mmol/LIPTG，6h)下等量菌液中兩種蛋白的表達結(jié)果。占細菌總蛋白41%的是GST蛋白，GST-PlGF－2123－144蛋白所占比例有所下降，約為34%;而GST-PlGF－2123－144蛋白表達量約為GST蛋白的83%。A:GST蛋白;B:GST-PlGF－2123－144蛋白圖4GST和GST-PlGF－2123－144蛋白的最適誘導(dǎo)表達條件的WesternBlot分析Figure4WesternBlotassayforoptimizationoftheinducedGSTandGST-PlGF－2123－144proteins2.4GST和GST-PlGF－2123－144蛋白的純化大量誘導(dǎo)表達GST和GST-PlGF－2123－144蛋白后，采用GlutathioneSepharose4B親和性膠泥純化可溶性目的蛋白，并在每個純化步驟完成后取少量樣品、進行了SDS-PAGE和WesternBlot分析。圖5考馬斯亮藍染色定量分析，GST洗脫液的純度分別為96%、98%和99%。GST-PlGF－2123－144的純度從72%、86%到97%。WesternBlot結(jié)果顯示，膠泥親和吸附的GST蛋白在332第36卷第5期2019年10月生物學(xué)雜志JOUＲNALOFBIOLOGYVol.36No.5Oct.2019???????????????????????????????????????????????
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