目的觀察多肽Apelin基因缺失對單側輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎間質纖維化的影響,探討在梗阻性腎病腎纖維化形成中Apelin的作用和可能機制。方法利用CRISPR/Cas9技術構建Apelin基因敲除小鼠(KO)共20只,同時選取野生型小鼠(WT) 20只,均為8周齡雄性C57BL/6J種系,采用隨機數字表法分為:KO+Sham組、KO+UUO組、WT+Sham組、WT+UUO組,每組各10只。分別對小鼠行單側輸尿管結扎(UUO)或假手術(Sham)。術后2周將小鼠處死,取血漿和手術側腎臟進行檢測。采用Masson染色觀察腎臟纖維化程度,免疫組織化學染色檢測腎臟基質成分纖維連接蛋白(FN)、Ⅰ型膠原(Col-I)的分布和表達情況。采用Western blotting法檢測腎小管上皮標志物E-鈣黏素(E-cadherin)、間充質標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA),以及致纖維化細胞因子--轉化生長因子-β1(TGF-β1)及其受體TGFβ-R1的蛋白表達量。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血漿肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平。結果KO+UUO組小鼠腎臟可見明顯的腎小管萎縮和腎間質纖維化,基質成分FN和Col-I表達量顯著升高。WT+UUO組小鼠腎臟的纖維化程度和基質的表達量均低于KO+UUO組,差異具有統(tǒng)計學意義(P 0. 05)。KO+Sham組和WT+Sham組腎臟無明顯的纖維化改變和基質的沉積。KO+UUO組小鼠,可見顯著的腎小管上皮-間充質轉分化(EMT)表現,E-cadherin減少,α-SMA增多,TGF-β1和TGFβ-R1受體的表達量也明顯升高。與KO+UUO組相比,WT+UUO組腎小管上皮E-cadherin的表達較多,α-SMA、TGF-β1和TGFβ-R1受體的表達均較低,差異具有統(tǒng)計學意義(P 0. 05)。而WT+Sham組和KO+Sham組小鼠上述標志物的表達趨于正常水平。KO+UUO組小鼠血漿Cr、BUN的水平最高,WT+UUO組小鼠上述標志物的水平均低于KO+UUO組,差異具有統(tǒng)計學意義(P 0. 05)。KO+Sham組小鼠血漿Cr、BUN與WT+Sham組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P 0. 05)。結論 Apelin在正常狀態(tài)下對腎功能無明顯影響,但在輸尿管梗阻狀態(tài)下其基因缺失可能是引起腎間質纖維化加重的因素。
【部分圖文】：

采用CRISPR/Cas9技術造成Apelin基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失。簡要過程如下:通過體外轉錄的方式，獲得Cas9 mRNA和gRNA;將其顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，獲得F0代小鼠。經PCR產物測序確認，共獲得9只目的基因蛋白讀碼框移碼的F0代小鼠。將F0代小鼠與C57BL/6J小鼠交配，獲得4個品系共計6只陽性F1代雜合子小鼠。再將F1代小鼠分成兩部分:一部分與野生型小鼠交配，擴群繁育較多的雜合子小鼠(WT);一部分自交，獲得基因敲除純合子小鼠(KD)。對小鼠進行基因敲除的效果驗證和表型分析見圖1。選取8周齡雄性C57BL/6J的KO小鼠和WT小鼠各20只，采用隨機數字表法分為:KO+Sham組、KO+UUO組、WT+Sham組、WT+UUO組，每組各10只。對小鼠進行假手術(Sham)或單側輸尿管結扎(UUO)操作。先給予小鼠腹腔注射1%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，備皮并消毒皮膚，于左側脊柱旁第13肋與大腿之間，縱行切開皮膚約1 cm，逐層分離組織，顯露腎臟，UUO組結扎并離斷輸尿管，逐層縫合腹膜及皮膚。Sham組除不對輸尿管進行結扎離斷外，其余操作步驟同UUO組。所有小鼠于術后2周處死，取手術側腎臟，將部分腎組織進行4%多聚甲醛固定、石蠟包埋及切片，待病理分析，其余部分裝入凍存管中于-80℃冰箱保存，用于提取組織蛋白。

Sham組WT和KO基因型小鼠的腎臟顯示，腎小球大小、形態(tài)正常，腎間質和腎小管未見明顯纖維化改變。UUO組兩種基因型小鼠的腎臟，部分腎小球硬化，腎間質可見炎性細胞浸潤，大部分腎小管變形、擴張，纖維化明顯，KO+UUO組腎臟的病變最重。半定量分析顯示，與WT+UUO組比較，KO+UUO組腎間質纖維化范圍增加[(50.50±4.17)%vs.(31.90±5.15)%]，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.227,P<0.05)。WT+Sham組和KO+Sham組腎臟纖維化面積極低，分別為(2.46±0.57)%和(6.49±4.73)%。見圖2。2.2 小鼠腎間質基質膠原的沉積

免疫組化染色顯示，Sham組WT和KO基因型小鼠的腎間質中FN和Col-I僅有少量細線樣分布表達。UUO組2種基因型小鼠的腎組織中，FN和Col-I在腎小管間質中呈密集的棕黃色“顆粒”狀或“條索”狀分布，間質細胞的胞質中也可見黃色顆粒，以KO+UUO組最明顯。半定量分析結果顯示，與WT+UUO組比較，KO+UUO組FN和Col-I的表達量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(FN:t=13.244,P<0.05;Col-I:t=9.234,P<0.05)。見圖3、表1。2.3 小鼠腎小管EMT標志物的表達
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