發(fā)布時間：2020-10-20 13:17

　　 目的表達高純度的抗苗勒管激素蛋白,以該蛋白作為抗原制備單克隆抗體,并鑒定抗體亞型,為進一步開發(fā)優(yōu)質(zhì)的抗苗勒管激素診斷試劑盒做技術(shù)儲備。方法在表達載體pET-28a(+)質(zhì)粒中接入經(jīng)密碼子優(yōu)化的抗苗勒管激素基因(AMH)片段,轉(zhuǎn)化于BL21細菌中,異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白大量表達,對上清中可溶性蛋白進行純化。使用SDS-PAGE分析純化蛋白的純度。經(jīng)純化的抗原蛋白3次皮下免疫小鼠,挑選產(chǎn)生高效價的抗體的小鼠,取其脾細胞,制備懸液。經(jīng)細胞雜交技術(shù)與骨髓瘤細胞進行融合,篩選能穩(wěn)定持久分泌抗AMH抗體的雜交瘤細胞株,并制備腹水抗體。通過親和層析技術(shù)、BCA蛋白檢測方法等測定手段,純化抗體、檢測抗體濃度。結(jié)果篩選到2株能持久分泌抗AMH蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別為克隆細胞株3F6和4E7,分泌抗體均為IgG1亞型。結(jié)論篩選出穩(wěn)定分泌高純度的抗苗勒管激素抗體的2株雜交瘤細胞,并制備單克隆抗體。下一步將其應(yīng)用于AMH檢測試劑盒的開發(fā)。
【部分圖文】：

經(jīng)過37℃誘導(dǎo)表達4 h和25℃誘導(dǎo)表達過液，菌體收集破碎，SDS-PAGE分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，AMH蛋白主要在包涵體中表達。37℃條件下，表達量更高且更省時，所以以37℃誘導(dǎo)表達4h，進行大量表達。經(jīng)SDS-PAGE膠分析，NI-NTA親和層析柱純化后的AMH蛋白純度達85%以上，蛋白分子量大約40 k左右。見圖2。圖2 SDS-PAGE分析AMH純化蛋白

SDS-PAGE分析AMH純化蛋白

抗體亞型鑒定
【參考文獻】

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本文編號：2848729