研究背景流感是危害人類健康的重大社會公共衛(wèi)生問題,每年在世界范圍內(nèi)造成25-50萬人死亡~([1])。近年來報道的H1N1、H5N1、H7N9等流感疫情,更是向流感病毒防治的研究發(fā)出嚴(yán)重挑戰(zhàn)。由于流感疫苗保護(hù)效果的不穩(wěn)定性,以及抗流感病毒藥物的療效受限于嚴(yán)重的耐藥問題,特別是流感重癥病患的救治缺乏有效的治療措施,抗病毒中和抗體被認(rèn)為是一種更具潛力的治療手段,通過優(yōu)化單克隆抗體分離克隆技術(shù)以及抗體改造,是獲得更好保護(hù)效果的中和抗體的更有效的研發(fā)策略。當(dāng)前,基于熒光素酶的病毒中和實(shí)驗(yàn)和雙異性抗體改造技術(shù)是用于抗體研發(fā)的重要方法。研究目的與方法本研究主要利用熒光流感病毒(IAV-Luc)微量中和的抗體篩選方法(BMN),并結(jié)合漿細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)和單細(xì)胞PCR技術(shù),分離克隆抗流感中和抗體。同時使用DVD-Ig和Cross-Mab雙特異抗體構(gòu)建技術(shù),研發(fā)可中和兩種流感病毒的雙特異性抗體。1.從免疫了季節(jié)性流感疫苗的志愿者外周血中分離漿母細(xì)胞,在含有IL-6的漿細(xì)胞培養(yǎng)體系中進(jìn)行單細(xì)胞體外培養(yǎng),使用低病毒量的熒光流感病毒微量中和法(BMN)篩選培養(yǎng)上清,對具有中和活性的孔細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞PCR獲得抗體基因,抗體表達(dá)后進(jìn)行HAI、病毒中和、抗原結(jié)合等活性分析檢測。2.利用DVD-Ig和Cross-Mabs兩種雙特異抗體構(gòu)建技術(shù),將分別針對H1/California/7/2009和H5/Hong Kong/482/1997的中和抗體206與4E6的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)建成雙特異抗體,并比較單克隆抗體母本與雙特異抗體的病毒中和和抗原結(jié)合活性的變化。研究結(jié)果:成功建立了利用BMN法測定單個漿細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒中和活性的方法,并從病毒中和活性陽性的單個漿細(xì)胞中成功分離克隆獲得了8株針對H1/CA09的中和抗體(Ab-2C、4E、3A、5A、B1、D5、4A、D7),而且Ab-2C、4E、3A、5A、B1、D5具有強(qiáng)中和H1/CA09病毒的活性,8個抗體均有H1/CA09 HA蛋白的結(jié)合活性。Ab-2C、4E、3A、4A和5A具有血凝抑制活性,表明它們是抗HA球部抗體。利用DVD-Ig或Cross-Mab雙特異性抗體構(gòu)建技術(shù),成功構(gòu)建體具備了針對H1/CA09和H5/HK97兩種亞型流感病毒的雙特異中和抗體。與母本抗體相比,雙特異性抗體的病毒中和活性下降,而且基于Cross-Mab技術(shù)的雙特異性抗體下降更明顯。結(jié)論:直接利用單細(xì)胞PCR從單個B淋巴細(xì)胞中克隆抗體基因工作量大、效率低,而使用熒光流感病毒微量中和法測定單個B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗病毒中和活性,再從具有中和活性的B細(xì)胞中克隆抗體基因,可以提高獲得中和抗體的效率,降低工作量。為后續(xù)的抗流感病毒中和抗體研發(fā)提供了一個高效的工具。同時,成功構(gòu)建了基于DVD-Ig和Cross-Mab技術(shù)的抗H1/CA09和H5/HK97雙特異性中和抗體,為開發(fā)針對不同亞型流感病毒的廣譜中和抗體奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

毒感染細(xì)胞過程中，無活性的 HA0 分子被裂解成 HA1 和 HA2，從而介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜結(jié)合與融合，這一過程賦予流感病毒感染性[3]。HA 蛋白成為目前流感疫苗研發(fā)的主要靶抗原，針對 HA 的中和抗體可阻斷病毒的感染。因?yàn)榱鞲胁《镜母叨茸儺愋裕槍?HA 的廣譜中和抗體成為了近年來的研發(fā)焦點(diǎn)[14]。廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文

毒感染細(xì)胞過程中，無活性的 HA0 分子被裂解成 HA1 和 HA2，從而介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜結(jié)合與融合，這一過程賦予流感病毒感染性[3]。HA 蛋白成為目前流感疫苗研發(fā)的主要靶抗原，針對 HA 的中和抗體可阻斷病毒的感染。因?yàn)榱鞲胁《镜母叨茸儺愋�，針�?HA 的廣譜中和抗體成為了近年來的研發(fā)焦點(diǎn)[14]。廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)合方式來應(yīng)對HA氨基酸多樣性以及由group1和group2特異的糖基化而形成的結(jié)構(gòu)限制[58.45.59-62]。由此可見，HA 蛋白莖部區(qū)域能更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生廣譜性更好的中和抗體，但是這類抗體的比例非常低，如何通過高效靈敏的方法大量篩選流感中和抗體，或者通過某種方法提高已有抗體的廣譜性的探索，將有助于流感病毒廣譜中和抗體研發(fā)。
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本文編號：2845398