人源DNA聚合酶δ(Polδ)是由p125、p68、p50及p12四個亞基組成的異源四聚體,它不僅是染色體基因組復(fù)制最主要的DNA聚合酶,還參與了細(xì)胞內(nèi)多種DNA損傷的修復(fù)過程。DNA聚合酶δ的高保真性及持續(xù)合成能力使得DNA能夠準(zhǔn)確、連續(xù)的復(fù)制,即:催化大亞基p125具有3’-5’核酸外切酶活性,能夠保證DNA復(fù)制時摻入的堿基是正確配對的,即使發(fā)生小概率的錯配,其錯配的堿基也會被外切酶活性所切除,從而保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確。除了在多種DNA損傷修復(fù)機制中發(fā)揮獨有的作用外,Polδ自身還是一個DNA損傷響應(yīng)的靶標(biāo),前期研究發(fā)現(xiàn),在UV或烷化劑等損傷試劑誘導(dǎo)下產(chǎn)生的DNA損傷過程中,p12亞基通過UbcH5c/RNF8(E2/E3)介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑降解,使得Polδ轉(zhuǎn)變?yōu)閷NA損傷有更強識別和糾錯能力的Polδ3形式以應(yīng)對;我們前期的研究還發(fā)現(xiàn),在相同的E2/E3調(diào)控系統(tǒng)下,p50亞基有被單泛素化修飾的跡象,但尚未獲得最終的確認(rèn)。鑒于p50亞基單泛素化修飾可能在跨損傷合成(修復(fù))途徑中介導(dǎo)Polδ與TLS聚合酶交換過程扮演重要角色,本論文研究首先通過建立的體外泛素化分析系統(tǒng),以UbcH5c/RNF8及Rad6/Rad18這兩種E2/E3調(diào)控系統(tǒng)對p50的單泛素化修飾進行了驗證,同時對Polδ其他亞基的泛素化修飾情況也進行了分析,結(jié)果表明,兩種E2/E3調(diào)控系統(tǒng)均能介導(dǎo)p50發(fā)生單泛素化修飾,且以UbcH5c/RNF8介導(dǎo)的p50單泛素化修飾程度更強,但這兩種調(diào)控系統(tǒng)均不能介導(dǎo)p125和p68發(fā)生泛素化反應(yīng);UbcH5c/RNF8能夠介導(dǎo)p12發(fā)生多泛素化反應(yīng),而Rad6/Rad18疑似能夠介導(dǎo)p12的單泛素化反應(yīng)。然后,利用UV射線處理培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞,觀察在DNA損傷情況下細(xì)胞內(nèi)p50的泛素化修飾情況,發(fā)現(xiàn)在UV誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA損傷的情況下,p50確實能夠發(fā)生單泛素化修飾。最后,通過亞細(xì)胞定位實驗,觀察到Polδ能夠與RNF8及TLS聚合酶Polε共定位到經(jīng)UV射線處理所產(chǎn)生的損傷點(域),表明細(xì)胞內(nèi)一旦發(fā)生DNA損傷,在p12經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解的同時,Polδ以缺失了p12的三聚體形式Polδ3與RNF8及Polε(當(dāng)然也包括其他多種修復(fù)相關(guān)的蛋白,例如PCNA等)被快速共募集到損傷點(域)參與跨損傷修復(fù),此時,RNF8可能介導(dǎo)p50亞基發(fā)生單泛素化修飾。根據(jù)以上實驗結(jié)果,我們假設(shè)了一種在TLS途徑中基于p50單泛素化修飾的聚合酶交換機制。本論文研究為深入理解跨損傷合成(修復(fù))途徑中聚合酶Polδ與TLS聚合酶的交換機制,也為今后以Polδ作為小分子抑制劑的潛在的新靶標(biāo),設(shè)計新的腫瘤診斷、治療手段來抗擊人類疾病如癌癥疾病等提供理論參考。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文的骨架互作。鍥入在核酸外切酶和手指結(jié)構(gòu)域且與手掌結(jié)構(gòu)域互作的 N-末端結(jié)構(gòu)域（NTD）與模板鏈上未配對的部分互作，催化核苷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)的兩個活性位點殘基（Asp608 和 Asp764）位于“手掌”結(jié)構(gòu)域，核酸外切酶活性位點殘基Asp321、Glu323 和 Asp407 位于單一的 Ca2+附近。聚合酶和核酸外切酶活性位點的距離約為 45 。Sc Pol3p 三元復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)的獲得，使得具有重要功能的氨基酸殘基的精確定位成為可能，也為 Pol 的遺傳和功能研究提供了基礎(chǔ)。

人源 DNA 聚合酶 小亞基 p50 泛素化修飾分析和中斷復(fù)制（Break-induced replication, BIR），均受 C 亞基的調(diào)控[22-26]，因此，這顯然依賴于 B 亞基與 C 亞基之間的互作，人源 p50 與 p66N端形成的復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)的獲得極大地促進了對兩者之間互作的理解。在 B 家族 DNA 聚合酶的 B 亞基之中，人源 Pol B 亞基的晶體結(jié)構(gòu)是第一個獲得的，這促進了對 B 亞基整體結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理解[27]。p50 與 C亞基 N-末端結(jié)構(gòu)域 144 個氨基酸形成復(fù)合體，在下文中稱為 p50·p66N。該結(jié)構(gòu)像 一 個 擴 展 的 腰 果 形 分 子 ， 包 含 了 3 個 結(jié) 構(gòu) 域 ： 磷 酸 二 酯 酶 樣（Phosphodiesterase-like, PDE）表面結(jié)構(gòu)域、p50 中的寡聚核苷酸/寡糖結(jié)合（oligonucleotide/oligosaccharide-binding,OB）結(jié)構(gòu)域以及 p66N端的有翼螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（winged helix-turn-helix,wHTH）結(jié)構(gòu)域（圖 1.2）。PDE 結(jié)構(gòu)域位于分子的中心，一側(cè)與 OB 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，另一側(cè)與 wHTH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

人源 DNA 聚合酶 小亞基 p50 泛素化修飾分析酸的 RNA 引物并且添加 10-20 個核苷酸的 DNA 以便進行延伸。隨后，通過聚合酶交換機制由 RFC-PCNA-Pol 復(fù)合物替代了 Pol ，并且起始了新生后隨鏈DNA 片段的持續(xù)合成[45-47, 50-55]。岡崎片段5’端附近產(chǎn)生的一些錯誤稱為 片段，通常由 Pol 的核酸外切酶活性校正[56]。如果它們逃避了校正，將通過 Pol 催化的鏈置換合成來將其移除，這與正常的岡崎片段的成熟（Okazaki FragmentMaturation, OFM）有關(guān)[46, 48, 57]。因此，通常認(rèn)為 Pol 負(fù)責(zé)后隨鏈的合成。
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2 李驍;劉留;張磊;周亞竟;;人源DNA聚合酶Pol δ小亞基p12的抗體制備及應(yīng)用[J];中國生物工程雜志;2012年05期

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本文編號：2842706