人源DNA聚合酶δ(Polδ)是由p125、p68、p50及p12四個亞基組成的異源四聚體,它不僅是染色體基因組復制最主要的DNA聚合酶,還參與了細胞內多種DNA損傷的修復過程。DNA聚合酶δ的高保真性及持續(xù)合成能力使得DNA能夠準確、連續(xù)的復制,即:催化大亞基p125具有3’-5’核酸外切酶活性,能夠保證DNA復制時摻入的堿基是正確配對的,即使發(fā)生小概率的錯配,其錯配的堿基也會被外切酶活性所切除,從而保證DNA復制的準確。除了在多種DNA損傷修復機制中發(fā)揮獨有的作用外,Polδ自身還是一個DNA損傷響應的靶標,前期研究發(fā)現(xiàn),在UV或烷化劑等損傷試劑誘導下產生的DNA損傷過程中,p12亞基通過UbcH5c/RNF8(E2/E3)介導的泛素-蛋白酶體途徑降解,使得Polδ轉變?yōu)閷NA損傷有更強識別和糾錯能力的Polδ3形式以應對;我們前期的研究還發(fā)現(xiàn),在相同的E2/E3調控系統(tǒng)下,p50亞基有被單泛素化修飾的跡象,但尚未獲得最終的確認。鑒于p50亞基單泛素化修飾可能在跨損傷合成(修復)途徑中介導Polδ與TLS聚合酶交換過程扮演重要角色,本論文研究首先通過建立的體外泛素化分析系統(tǒng),以UbcH5c/RNF8及Rad6/Rad18這兩種E2/E3調控系統(tǒng)對p50的單泛素化修飾進行了驗證,同時對Polδ其他亞基的泛素化修飾情況也進行了分析,結果表明,兩種E2/E3調控系統(tǒng)均能介導p50發(fā)生單泛素化修飾,且以UbcH5c/RNF8介導的p50單泛素化修飾程度更強,但這兩種調控系統(tǒng)均不能介導p125和p68發(fā)生泛素化反應;UbcH5c/RNF8能夠介導p12發(fā)生多泛素化反應,而Rad6/Rad18疑似能夠介導p12的單泛素化反應。然后,利用UV射線處理培養(yǎng)的HeLa細胞,觀察在DNA損傷情況下細胞內p50的泛素化修飾情況,發(fā)現(xiàn)在UV誘導產生DNA損傷的情況下,p50確實能夠發(fā)生單泛素化修飾。最后,通過亞細胞定位實驗,觀察到Polδ能夠與RNF8及TLS聚合酶Polε共定位到經UV射線處理所產生的損傷點(域),表明細胞內一旦發(fā)生DNA損傷,在p12經泛素-蛋白酶體途徑降解的同時,Polδ以缺失了p12的三聚體形式Polδ3與RNF8及Polε(當然也包括其他多種修復相關的蛋白,例如PCNA等)被快速共募集到損傷點(域)參與跨損傷修復,此時,RNF8可能介導p50亞基發(fā)生單泛素化修飾。根據以上實驗結果,我們假設了一種在TLS途徑中基于p50單泛素化修飾的聚合酶交換機制。本論文研究為深入理解跨損傷合成(修復)途徑中聚合酶Polδ與TLS聚合酶的交換機制,也為今后以Polδ作為小分子抑制劑的潛在的新靶標,設計新的腫瘤診斷、治療手段來抗擊人類疾病如癌癥疾病等提供理論參考。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

江蘇大學碩士學位論文的骨架互作。鍥入在核酸外切酶和手指結構域且與手掌結構域互作的 N-末端結構域（NTD）與模板鏈上未配對的部分互作，催化核苷酸轉移反應的兩個活性位點殘基（Asp608 和 Asp764）位于“手掌”結構域，核酸外切酶活性位點殘基Asp321、Glu323 和 Asp407 位于單一的 Ca2+附近。聚合酶和核酸外切酶活性位點的距離約為 45 。Sc Pol3p 三元復合體晶體結構的獲得，使得具有重要功能的氨基酸殘基的精確定位成為可能，也為 Pol 的遺傳和功能研究提供了基礎。

人源 DNA 聚合酶 小亞基 p50 泛素化修飾分析和中斷復制（Break-induced replication, BIR），均受 C 亞基的調控[22-26]，因此，這顯然依賴于 B 亞基與 C 亞基之間的互作，人源 p50 與 p66N端形成的復合體的晶體結構的獲得極大地促進了對兩者之間互作的理解。在 B 家族 DNA 聚合酶的 B 亞基之中，人源 Pol B 亞基的晶體結構是第一個獲得的，這促進了對 B 亞基整體結構及其結構-功能關系的理解[27]。p50 與 C亞基 N-末端結構域 144 個氨基酸形成復合體，在下文中稱為 p50·p66N。該結構像 一 個 擴 展 的 腰 果 形 分 子 ， 包 含 了 3 個 結 構 域 ： 磷 酸 二 酯 酶 樣（Phosphodiesterase-like, PDE）表面結構域、p50 中的寡聚核苷酸/寡糖結合（oligonucleotide/oligosaccharide-binding,OB）結構域以及 p66N端的有翼螺旋-轉角-螺旋（winged helix-turn-helix,wHTH）結構域（圖 1.2）。PDE 結構域位于分子的中心，一側與 OB 結構域結合，另一側與 wHTH 結構域結合。

人源 DNA 聚合酶 小亞基 p50 泛素化修飾分析酸的 RNA 引物并且添加 10-20 個核苷酸的 DNA 以便進行延伸。隨后，通過聚合酶交換機制由 RFC-PCNA-Pol 復合物替代了 Pol ，并且起始了新生后隨鏈DNA 片段的持續(xù)合成[45-47, 50-55]。岡崎片段5’端附近產生的一些錯誤稱為 片段，通常由 Pol 的核酸外切酶活性校正[56]。如果它們逃避了校正，將通過 Pol 催化的鏈置換合成來將其移除，這與正常的岡崎片段的成熟（Okazaki FragmentMaturation, OFM）有關[46, 48, 57]。因此，通常認為 Pol 負責后隨鏈的合成。
【相似文獻】

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1 陳煒;周亞竟;;跨損傷合成途徑中真核生物DNA聚合酶δ轉換機制的研究進展[J];生物學雜志;2018年03期

2 李驍;劉留;張磊;周亞竟;;人源DNA聚合酶Pol δ小亞基p12的抗體制備及應用[J];中國生物工程雜志;2012年05期

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1 曹小年;p55PIK在結直腸癌細胞增殖中的作用及其轉錄后調控機制的研究[D];華中科技大學;2014年

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1 劉鳳玉;人源DNA聚合酶δ小亞基p50泛素化修飾分析[D];江蘇大學;2018年

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本文編號：2842706