本文關(guān)鍵詞：甲型流感病毒與宿主細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甲型流感病毒(Influenza A virus)是單股負(fù)鏈RNA病毒,可通過呼吸道感染造成人類及動(dòng)物流行性感冒,對人類健康造成嚴(yán)重威脅。甲型流感病毒入侵宿主細(xì)胞并在其中進(jìn)行復(fù)制、繁殖等過程由于多種宿主細(xì)胞蛋白和病毒蛋白的參與而變得錯(cuò)綜復(fù)雜。而且流感病毒與宿主相互作用機(jī)制仍有許多未知,加之流感病毒易發(fā)生變異,更加增大流感病毒藥物的研發(fā)及人類疾病防控的難度。因而尋找高效精確的研究方法是完善病毒與宿主互作機(jī)制及加速病毒藥物研發(fā)的重中之重。首先我們選用流感病毒H7N9毒株的NP蛋白作為研究對象,采用免疫共沉淀及質(zhì)譜鑒定的方法富集并檢測與NP蛋白相互作用的宿主蛋白,通過大量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)132個(gè)相關(guān)蛋白,其中有17種蛋白涉及剪切體細(xì)胞信號通路,推斷H7N9流感病毒的NP蛋白可能參與宿主細(xì)胞應(yīng)對病毒感染所引起的剪切體通路應(yīng)答。然而,免疫共沉淀的方法對于實(shí)現(xiàn)高通量的研究目標(biāo)具有很大難度,所以我們還采用了另一種方法對流感病毒與宿主相互作用進(jìn)行研究,即將化學(xué)生物學(xué)的概念和研究策略與蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合,利用特異性的化學(xué)分子探針通過生物正交反應(yīng)對H1N1感染宿主后不同時(shí)間點(diǎn)的新生成蛋白進(jìn)行富集及質(zhì)譜鑒定。從而對流感病毒H1N1侵染宿主細(xì)胞過程所引起的蛋白質(zhì)組的微小變化進(jìn)行表征,在一定程度上實(shí)現(xiàn)了高通量、高精確性的研究目標(biāo)。通過大量質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了2859個(gè)宿主蛋白在H1N1感染過程中表達(dá)水平存在變化。為后續(xù)甲型流感病毒與宿主相互作用的研究提供大量數(shù)據(jù)及新方法。本研究將對于完善流感病毒逃避免疫監(jiān)視并形成持續(xù)感染或?qū)C(jī)體造成損害的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)及防治途徑具有非常重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：蛋白質(zhì)組 生物正交反應(yīng) 甲型流感病毒 相互作用 新生成蛋白
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R373.13
【目錄】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮寫詞表12-13
• 第一章 緒論13-23
• 1.1 甲型流感病毒及與宿主相互作用的研究進(jìn)展13-16
• 1.1.1 流感病毒的主要蛋白13-15
• 1.1.2 目前流感病毒與宿主相互作用的研究進(jìn)展15-16
• 1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)及其在流感病毒研究中的進(jìn)展16-18
• 1.2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述16-17
• 1.2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在流感病毒研究中的應(yīng)用及其局限性17-18
• 1.3 生物正交反應(yīng)概述及應(yīng)用18-23
• 1.3.1 生物正交反應(yīng)的特點(diǎn)18-20
• 1.3.2 生物正交反應(yīng)的應(yīng)用20-23
• 第二章 H7N9 NP蛋白與宿主相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究23-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 2.2.1 H7N9 NP質(zhì)粒構(gòu)建、擴(kuò)增23-24
• 2.2.2 293T細(xì)胞培養(yǎng)24
• 2.2.3 pCMV-NP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞24
• 2.2.4 免疫共沉淀24-25
• 2.2.5 SDS-PAGE電泳與免疫印跡25-26
• 2.2.6 緩沖液替換及胰蛋白酶裂解26
• 2.2.7 Nano-LC-MS/MS質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)檢索26-27
• 2.2.8 生物信息學(xué)分析及Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論27-35
• 2.3.1 NP蛋白表達(dá)及免疫共沉淀27-29
• 2.3.2 質(zhì)譜鑒定與NP蛋白相互作用的宿主蛋白29-30
• 2.3.3 宿主蛋白賴氨酸乙�；揎�30-32
• 2.3.4 生物信息學(xué)分析及結(jié)果驗(yàn)證32-35
• 2.4 小結(jié)35-37
• 第三章 生物正交反應(yīng)及檢測方法的建立37-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法37-42
• 3.2.1 293T細(xì)胞的培養(yǎng)37-38
• 3.2.2 細(xì)胞影像學(xué)分析方法的建立（細(xì)胞水平標(biāo)記）38-39
• 3.2.3 蛋白水平標(biāo)記方法的建立39-40
• 3.2.4 新生成蛋白ELISA檢測方法的建立40-41
• 3.2.5 新生成蛋白免疫印跡檢測方法的建立41
• 3.2.6 新生成蛋白質(zhì)譜檢測方法的建立41-42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論42-47
• 3.3.1 細(xì)胞影像學(xué)分析方法建立結(jié)果42-43
• 3.3.2 蛋白水平生物正交反應(yīng)標(biāo)記熒光分子43-44
• 3.3.3 新生成蛋白ELISA檢測方法的建立結(jié)果44
• 3.3.4 新生成蛋白免疫印跡檢測方法的建立結(jié)果44-45
• 3.3.5 PD-10 除鹽柱富集條件探索結(jié)果45
• 3.3.6 親和純化方法條件確立結(jié)果45-46
• 3.3.7 新生成蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果46-47
• 3.4 小結(jié)47-48
• 第四章 流感病毒感染及非天然氨基酸標(biāo)記條件優(yōu)化48-56
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法48-50
• 4.2.1 甲型流感病毒H1N1擴(kuò)增48
• 4.2.2 血球凝集(HA)試驗(yàn)與TCID_(50)測定48-49
• 4.2.3 非天然氨基酸AHA處理Vero細(xì)胞時(shí)間的確定49-50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論50-55
• 4.3.1 流感病毒H1N1感染劑量確定50-51
• 4.3.2 細(xì)胞水平觀察AHA處理Vero不同時(shí)間新生蛋白情況51-52
• 4.3.3 ELISA檢測AHA處理Vero細(xì)胞不同時(shí)間新生蛋白情況52-54
• 4.3.4 質(zhì)譜檢測結(jié)果54-55
• 4.4 小結(jié)55-56
• 第五章 H1N1感染Vero細(xì)胞及新生成蛋白的檢測與分析56-67
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料56
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法56-58
• 5.2.1 H1N1感染Vero細(xì)胞顯微成像56-57
• 5.2.2 H1N1感染Vero細(xì)胞獲得新生成蛋白質(zhì)組及檢測分析57-58
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論58-66
• 5.3.1 H1N1感染Vero細(xì)胞系顯微成像結(jié)果58-59
• 5.3.2 ELISA檢測H1N1感染Vero不同時(shí)間后新生成蛋白的變化59
• 5.3.3 免疫印跡方法檢測部分時(shí)間點(diǎn)新生成蛋白情況59-60
• 5.3.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果60-66
• 5.4 小結(jié)66-67
• 第六章 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 附錄75-90
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果90-91
• 致謝91

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