目的:探討Scleraxis慢病毒載體介導(dǎo)hAMSCs后體外向人韌帶成纖維細(xì)胞分化的潛能與效果。方法:1)取人羊膜經(jīng)胰酶和膠原酶消化分離hAMSCs,反復(fù)貼壁純化后進(jìn)行表型鑒定;透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu);CCK-8法檢測hAMSCs增殖活性;定向分化21d后,分別使用不同染色方法檢測hAMSCs向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的分化效果。2)取人交叉韌帶殘端經(jīng)酶消化法分離培養(yǎng)h LFs,使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力,并與hAMSCs相比較;實(shí)時熒光定量PCR檢測并比較兩種細(xì)胞I型膠原、腱調(diào)蛋白(Tenomodulin),Mohawk及Scleraxis相對表達(dá)量。3)構(gòu)建人Scleraxis基因質(zhì)粒,經(jīng)293T細(xì)胞對病毒進(jìn)行收集、滴度測定及MOI測定后轉(zhuǎn)染hAMSCs,RT-PCR和Westen Blot對Scx在hAMSCs中表達(dá)驗(yàn)證后,篩選持續(xù)分泌Scx的hAMSCs,測定韌帶相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)程度,并與Matrigel水凝膠混合后移植裸鼠皮下觀察分化效果。結(jié)果:1)酶消化法獲得大量可穩(wěn)定增殖的hAMSCs,成長梭形、漩渦狀生長貼長;透射電鏡顯示hAMSCs呈橢圓形,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞表面有少量微絨毛,染色質(zhì)分布均勻,胞漿內(nèi)可見豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及排列規(guī)則的線粒體;流式表型鑒定示hAMSCs符合MSCs表型。成骨定向誘導(dǎo)后出現(xiàn)多個鈣化結(jié)節(jié);甲苯胺藍(lán)染色呈示細(xì)胞合成多量糖胺聚糖;油紅O染色顯示胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色脂滴。倒置相差顯微鏡觀察顯示,hLFs原代時多以長梭形貼壁生長,細(xì)胞核圓形,原代細(xì)胞數(shù)量較少;傳代后呈長梭狀并可見漩渦樣集落;CCK-8顯示hlFs呈“S”形生長曲線,但增殖能力明顯低于hAMSCs(P0.05);PCR結(jié)果顯示,h LFs表達(dá)I型膠原、腱調(diào)蛋白(Tenomodulin),Mohawk及Scleraxis的mRNA水平均高于hAMSCs(P0.05)。2)酶切產(chǎn)物、菌液PCR檢測均顯示條帶大小為600bp,梯度法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后篩選出滴度為1×10~8TU/μL的病毒原液。以6.5μL病毒原液轉(zhuǎn)染hAMSCs 96h后熒光表達(dá)量示轉(zhuǎn)染良好,并以3.5μg/m L濃度的puromycin對細(xì)胞進(jìn)行篩選。RT-PCR顯示過表達(dá)組Scx表達(dá)量在3天、7天均高于空質(zhì)粒組(P0.05),7天時Scx表達(dá)量高于3天(P0.05)。Westen Blot顯示轉(zhuǎn)染組Scx蛋白表達(dá)量高于空質(zhì)粒組。3)PCR顯示hAMSCs轉(zhuǎn)染Scx后Ⅲ型膠原、賴氨酰氧化酶-1(LOX-1)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、腱調(diào)蛋白(Tenomodulin,Tnmd)核心蛋白聚糖(Dceorin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、和細(xì)胞連接素(Tenascin-C)的mRNA表達(dá)水平于3d、5d和7d時高于空質(zhì)粒組(P0.05),但仍低于h LFs組(P0.05);而I型膠原熒光5天時強(qiáng)于各組,但7天時與hLFs組表達(dá)量無明顯差異。Western blot結(jié)果顯示各組I、Ⅲ型膠原,纖維連接蛋白和細(xì)胞連接素的分泌水平隨時間的延長而增強(qiáng),實(shí)驗(yàn)組和hLFs組表達(dá)量均高于空質(zhì)粒組(P0.05)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)每組的I型膠原及Fibeonectin表達(dá)量隨時間增長,h LFs組表達(dá)量在3d和7d時分泌量均高于過表達(dá)組和空質(zhì)粒組。過表達(dá)組細(xì)胞與Matrigel水凝膠混合并移植裸鼠皮下28d后未見明顯炎癥反應(yīng),HE染色示細(xì)胞排列更為緊密與規(guī)則,形態(tài)趨近于正常韌帶組織。結(jié)論:1)酶消化和貼壁法體外培養(yǎng)的hAMSCs具有MSC的表型和特性。hLFs體外增殖能力hAMSCs較弱但韌帶相關(guān)基因表達(dá)水平較強(qiáng)高,證實(shí)Scleraxis為hAMSCs和hLFs的差異性基因。2)構(gòu)建的Scleraxis基因慢病毒載體在體外轉(zhuǎn)染hAMSCs后能穩(wěn)定表達(dá)且不影響細(xì)胞的增殖能力,成功建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。3)慢病毒介導(dǎo)Scx轉(zhuǎn)染hAMSCs后能夠提高韌帶相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平,分化形態(tài)更趨向成纖維細(xì)胞,體內(nèi)移植后無明顯炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

圖 1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（40×）Fig.1 Morphological characteristic of hAMSCs. (40×)Note: A: Primary cultured hAMSCs(24h); B: P1 generation of hAMSCs;C: P2 generation of hAMSCs; D: P3 generationof hAMSCs2.2 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定及純度分析P3 代人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測結(jié)果示：CD44、CD90、CD105、CD73表達(dá)陽性；CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR 表達(dá)陰性（圖 2）。

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測第 3 代 hAMSCs 表型分子Fig.2 Phenotype molecule expression of the 3rd generation of hAMSCs by flow cytometry.Note: A: CD44; B: CD90; C: CD73; D:CD105; E:CD34+CD19+CD45+CD11b+HLA-DR2.3 染色法觀察人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨、成軟骨及成脂細(xì)胞分化人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng) 21d 后，可見細(xì)胞逐漸匯合成短棒狀，體積變大，逐漸融合成片狀并形成鈣結(jié)節(jié)。茜素紅染色示鈣化結(jié)節(jié)比較分散，單個結(jié)節(jié)呈現(xiàn)為橘紅色沉淀；成軟骨培養(yǎng) 21d 后，觀察細(xì)胞基質(zhì)中分泌大量被染為藍(lán)色糖胺聚糖；成脂誘導(dǎo) 21d 后，鏡下見細(xì)胞立體感明顯，并出現(xiàn)脂滴，油紅-O 染色顯示脂肪沉積（圖 3）。

圖 3 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨、成軟骨及成脂細(xì)胞分化后 21d 染色結(jié)果（100×）Fig.3 The staining results of differentiation of hAMSCs into osteocytes, chondrocytes andlipocytes at 21 (100×)Note: A: osteocytes at day 21 by Alizarin Red staining (100×); B: chondrocytes at day 21 by Toluidine Blue staining(100×); C: lipocytes at day 21 by Oil Red O staining (100×)2.4 透射電鏡觀察可見 hAMSCs 呈橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞表面有少量微絨毛，染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)可見豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及排列規(guī)則的線粒體（圖 4）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2833232