【目的】觀察ZHX1在D-半乳糖誘導(dǎo)的耳蝸毛細(xì)胞株OC-1擬老化模型中的表達(dá)情況,初步探討ZHX1在老年性聾發(fā)病過程中可能的作用及機(jī)制�！痉椒ā�(1)耳蝸毛細(xì)胞株用不同濃度梯度的D-半乳糖作用48h,CCK-8檢測細(xì)胞活性,篩選出15mg/ml的濃度來建立擬老化模型。(2)按照不同的處理方式進(jìn)行以下分組:1)C組:對照組,用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,不做特殊處理;2)D組:D-半乳糖組,用濃度為15mg/ml的D-半乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h;3)NC組:轉(zhuǎn)染陰性對照組,與目的基因序列無同源性,轉(zhuǎn)染6h后,改用15mg/ml D-半乳糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h;4)Si組:ZHX1沉默組,含目的基因ZHX1的si RNA,轉(zhuǎn)染6h后,改用15mg/ml D-半乳糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。(3)分別使用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu);RT-PCR檢測線粒體DNA缺失率(CD);Annexin V-PI匹配使用,檢測細(xì)胞凋亡率;DCFH-DA探針作標(biāo)記,檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量;JC-1探針法檢測細(xì)胞線粒體膜電位,并用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察;酶標(biāo)儀比色法檢測GSH、MDA、ATP的含量,及SOD、CAT的活力;RT-PCR檢測P16、P21、ZHX1、TWIST1、Bcl-2、NRF-1的m RNA表達(dá)水平;Western blot檢測ZHX1、Bcl-2、Bax、caspase-3、NRF-1的蛋白表達(dá)水平�！窘Y(jié)果】(1)透射電鏡的結(jié)果顯示,C組的細(xì)胞外形規(guī)則,胞膜完整,胞質(zhì)均勻致密,含有豐富的細(xì)胞器,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)完整、清晰;D組的細(xì)胞外形欠規(guī)則,有較為明顯的內(nèi)陷,核膜完整性被破壞,出現(xiàn)核碎片,細(xì)胞質(zhì)疏松紊亂,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)變形,線粒體嵴減少、腫脹,甚至出現(xiàn)空泡。(2)D組的CD缺失率較C組升高,P16和P21的m RNA表達(dá)水平上調(diào)。(3)D組的細(xì)胞活性氧含量較C組升高。(4)D組和NC組的細(xì)胞凋亡率較C組升高,Si組較NC組升高。(5)D組和NC組的線粒體膜電位水平較C組降低,Si組較NC組降低。(6)D組和NC組的SOD、CAT活力及GSH、ATP含量均較C組降低,MDA含量升高;Si組與NC組比較,SOD、CAT活力和GSH、ATP含量降低,MDA含量升高。(7)RT-PCR檢測m RNA表達(dá)水平,D組和NC組的ZHX1、TWIST1、Bcl-2和NRF-1的表達(dá)水平均較C組降低,Si組的ZHX1、Bcl-2和NRF-1的表達(dá)水平較NC組降低,TWIST1的表達(dá)水平則無明顯區(qū)別。(8)Western blot檢測蛋白表達(dá)水平,D組和NC組的ZHX1、NRF-1的表達(dá)水平較C組降低,Bcl-2/Bax比值降低,活性caspase-3的表達(dá)水平升高,Si組與NC組比較,ZHX1、NRF-1的表達(dá)水平降低,Bcl-2/Bax比值降低,活性caspase-3的表達(dá)水平升高�！窘Y(jié)論】(1)在一定時間內(nèi)給予耳蝸毛細(xì)胞株高濃度的D-半乳糖處理,可使細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增多,CD缺失率升高,P16和P21表達(dá)水平上調(diào),細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退行性改變,說明我們成功建立體外耳蝸毛細(xì)胞株的擬老化模型。(2)用si RNA可以有效干擾ZHX1的表達(dá),影響細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的進(jìn)程,ZHX1可能在耳蝸毛細(xì)胞株的衰老過程中起保護(hù)作用。(3)ZHX1可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和NRF-1的表達(dá)水平發(fā)揮作用。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R-332;R764.436
【部分圖文】：

1.耳蝸毛細(xì)胞株的形態(tài)觀察（×40） （×200）圖1. 用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，在光鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞株的形態(tài)。2.細(xì)胞活性檢測圖2. 用不同濃度梯度的D-半乳糖處理細(xì)胞48h后檢測細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)濃度大于15mg/ml時，耳蝸毛細(xì)胞株的活性明顯降低，決定采用15mg/ml作為處理?xiàng)l件，**P＜0.01，***P＜0.001。

圖1. 用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，在光鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞株的形態(tài)。2.細(xì)胞活性檢測圖2. 用不同濃度梯度的D-半乳糖處理細(xì)胞48h后檢測細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)濃度大于15mg/ml時，耳蝸毛細(xì)胞株的活性明顯降低，決定采用15mg/ml作為處理?xiàng)l件，**P＜0.01，***P＜0.001。

組：對照組；D組：D-半乳糖組。D-半乳糖作用48h后，D組的CD升高，**P＜0.01。耳蝸毛細(xì)胞株的超微結(jié)構(gòu)鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞株的超微結(jié)構(gòu)，如圖所示，對照組的細(xì)胞形態(tài)整，胞質(zhì)均勻致密，含有豐富的細(xì)胞器，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)完-半乳糖組的細(xì)胞外形欠規(guī)則，有較為明顯的內(nèi)陷，核膜完整性被破片，細(xì)胞質(zhì)疏松紊亂，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)變形，線粒體嵴減少、腫脹，甚

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本文編號：2833192