發(fā)布時(shí)間：2020-09-23 06:34

　　 中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是一種新發(fā)的高致病性冠狀病毒,其致死率高達(dá)35%,而2003年流行的SARS冠狀病毒致死率僅為10%。MERS-CoV受體為人DPP4蛋白,由于不同種屬DPP4分子的差異,導(dǎo)致該病毒不能感染常見的小鼠、倉鼠等動(dòng)物,缺乏合適實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。另外,目前仍然缺乏臨床患者病理損傷相關(guān)的研究,對(duì)該病毒感染導(dǎo)致的組織病理損傷特征及致病機(jī)制知之甚少。已有的有限的研究資料顯示免疫介導(dǎo)的病理損傷在MERS-CoV致病中可能發(fā)揮著重要作用。我們的前期研究結(jié)果表明,高致病禽流感H5N1、H7N9等病毒感染所致補(bǔ)體異常會(huì)導(dǎo)致肺損傷。這提示我們補(bǔ)體異�？赡茉贛ERS-CoV致病過程中有同樣的作用。本研究旨在構(gòu)建一種能感染MERS-CoV的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并進(jìn)行MERS-CoV感染致病機(jī)制研究。1.MERS-CoV感染hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立。首先我們對(duì)hDPP4基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,人工合成該基因后構(gòu)建入真核表達(dá)載體,將載體轉(zhuǎn)染不表達(dá)DPP4蛋白的COS-7細(xì)胞,利用免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證了載體在細(xì)胞水平的表達(dá)和表達(dá)的蛋白的生物學(xué)功能。將驗(yàn)證的載體線性化后顯微注射入小鼠受精卵,移植假孕鼠獲得轉(zhuǎn)基因首建鼠,將首建鼠與野生型小鼠雜交,篩選獲得轉(zhuǎn)基因純合小鼠并擴(kuò)大繁育用于實(shí)驗(yàn)。在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,用MERS-CoV滴鼻感染hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠,結(jié)果顯示感染后第4天小鼠開始出活動(dòng)力下降和顯著的體重減輕,至感染第10天全部死亡。說明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠能感染MERS-CoV,并且感染可致小鼠死亡。2.hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠MERS-CoV感染特征研究。在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,用MERS-CoV感染hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠,對(duì)照組用DMEM模擬感染,觀察小鼠生存狀態(tài)和存活率,并記錄小鼠體重變化。在特定時(shí)間點(diǎn)取小鼠肺、脾、腎、腦、肝和血清,組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)五種組織都有不同程度的病理學(xué)損傷;免疫組化、實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在肺、腎、腦中有大量病毒抗原的表達(dá)與復(fù)制;免疫組化還檢測(cè)到肺、脾、腎、肝中大量炎性細(xì)胞浸潤,Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)到血清IFN-γ、IP-10、IL-17等細(xì)胞因子顯著升高。3.補(bǔ)體在MERS-CoV感染所致多器官損傷中的機(jī)制研究。首先用MERS-CoV感染hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠,免疫組化和ELISA等方法檢測(cè)小鼠補(bǔ)體的激活。結(jié)果顯示,在小鼠肺組織中有大量C5b-9的沉積與C5aR的表達(dá),血清中C5a也大量升高,證明MERS-CoV感染可引起補(bǔ)體大量激活。為探索補(bǔ)體在MERS-CoV所致組織損傷中的作用,在感染前尾靜脈注射抗小鼠C5aR抗體,阻斷C5a與C5aR的結(jié)合。結(jié)果顯示,阻斷C5a-C5aR補(bǔ)體通路后,可以減輕肺組織與全身炎癥反應(yīng);減少肺組織中病毒復(fù)制;減輕肺組織、脾組織損傷;促進(jìn)脾細(xì)胞再生,減少脾細(xì)胞凋亡。本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功獲得了hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠,并利用該小鼠建立了MERS-CoV致死性感染模型。該模型能較好的模擬臨床病人感染狀態(tài),將在MERS-CoV致病機(jī)制與藥物疫苗評(píng)價(jià)中發(fā)揮重要作用。MERS-CoV感染hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠后會(huì)引起宿主補(bǔ)體過度激活和異常的免疫反應(yīng),用抗C5aR抗體阻斷C5a-C5aR補(bǔ)體途徑后能顯著降低異常的免疫反應(yīng),有效減輕過度免疫反應(yīng)造成的免疫組織病理損傷。本研究揭示了MERS-CoV感染所致組織損傷新機(jī)制,為MERS-CoV感染的防治提供了一條新的免疫干預(yù)治療策略。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R511;R-332
【部分圖文】：

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文別為 2301bp 的 hDPP4 目的基因條帶和 4821bp 的 pCAGGS 載體，結(jié)果與（圖 1.2）；用特異性引物 DP42-F/R 對(duì)不同濃度的 pCAGGS-hDPP4 重組PCR 擴(kuò)增，5×10-4ng~5ng 范圍內(nèi)的質(zhì)粒均能擴(kuò)增出 439bp 的目的條帶，而L/6 小鼠基因組 DNA 沒有擴(kuò)增出條帶（圖 1.3），說明 pCAGGS-hDPP4 重確，而且轉(zhuǎn)入小鼠基因組后，在后續(xù)的轉(zhuǎn)基因小鼠 PCR 鑒定中不會(huì)產(chǎn)生條帶。胞免疫熒光檢測(cè)人 DPP4 蛋白的表達(dá)鑒定正確的pCAGGS-hDPP4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不表達(dá)DPP4蛋白的COS-7細(xì)ITC 標(biāo)記的大鼠抗人 DPP4 抗體，通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)人 DP表達(dá)。結(jié)果如圖 1.4 所示，與轉(zhuǎn)染 pCAGGS 空質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)GS-hDPP4 重 組 質(zhì) 粒 的 COS-7 細(xì) 胞 呈 現(xiàn) 很 強(qiáng) 的 綠 色 熒 光 ， 說GS-hDPP4 重組質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中表達(dá)人 DPP4 分子。A B

圖 1.5：免疫熒光檢測(cè) DPP4 分子與 MERS-RBD 的結(jié)合A：pCAGGS 質(zhì)粒；B：pCAGGS-hDPP4 重組質(zhì)粒2.4 hDPP4 轉(zhuǎn)基因載體的顯微注射及 hDPP4 轉(zhuǎn)基因首建鼠的鑒定在 hDPP4 轉(zhuǎn)基因小鼠制備過程中，顯微注射后共獲得 500 枚成活的受精卵分別移植到 25 只假孕母鼠體內(nèi)，其中 7 只懷孕，懷孕率為 28%；出生仔鼠 39 只，產(chǎn)仔率為 7.80%。以 PCR 方法鑒定仔鼠的鼠尾 DNA，共獲得 7 只 hDPP4 轉(zhuǎn)基因陽性鼠，陽性率為 17.9%。圖 1.6 所示為 hDPP4 轉(zhuǎn)基因首建鼠的 PCR 鑒定結(jié)果。A B

轉(zhuǎn)染 COS-7 細(xì)胞后，利用 MERS-RBD-Fc 蛋白和 DyLight 594 標(biāo)記的山羊抗人 IgG抗體，通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)人 DPP4 蛋白與病毒受體結(jié)合區(qū)（RBD）的結(jié)合功能。結(jié)果如圖1.5所示，與轉(zhuǎn)染pCAGGS空質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pCAGGS-hDPP4重組質(zhì)粒的 COS-7 細(xì)胞呈現(xiàn)很強(qiáng)的紅色熒光，說明表達(dá)的人 DPP4 分子有和MERS-CoV 受體結(jié)合區(qū)（RBD）結(jié)合的功能。A B

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2 董田甜;任雁;鄒莉波;李增剛;王捷;;轉(zhuǎn)基因小鼠模型在致癌實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2011年08期

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