[目的]初步探究復(fù)合黏膜免疫佐劑(Chi-CpG NP、Chi-C48/80 NP)的理化性質(zhì)及相關(guān)特性,檢測(cè)其輔佐B群腦膜炎奈瑟菌0315(Neisseria meningitides serogroup B,NMB0315)重組蛋白滴鼻免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,特別是黏膜免疫應(yīng)答水平及其免疫保護(hù)效果,為尋找合適的黏膜免疫佐劑、研制高效B群流腦疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]1.用殼聚糖納米顆粒(Chi NP)分別包裹免疫刺激分子(CpG-ODN或C48/80)合成復(fù)合黏膜免疫佐劑(Chi-CpG NP、Chi-C48/80 NP),透射電子顯微鏡(TEM)觀察形態(tài),Zetasizer Nano-ZS測(cè)定電勢(shì)電位及聚合物分散指數(shù)(PDI),測(cè)定上清液游離的免疫刺激分子含量計(jì)算裝載率;BCA法測(cè)定對(duì)重組蛋白NMB0315(r NMB0315)的吸附率;2.制備r NMB0315疫苗:擴(kuò)大培養(yǎng)含p ET-30a/NMB0315質(zhì)粒的E.coli BL21重組菌株(本課題組構(gòu)建保存),誘導(dǎo)表達(dá)r NMB0315隨后經(jīng)His親和層析柱純化,純化的r NMB0315用Western Blot鑒定。3.檢測(cè)r NMB0315疫苗的免疫活性及免疫保護(hù)效果:將所制備的Chi-CpG NP、Chi-C48/80 NP分別與純化的r NMB0315以一定比例充分混合、吸附,滴鼻免疫雌性BALB/c小鼠,收集小鼠鼻腔灌洗液、陰道分泌物和血清,采用間接ELISA法測(cè)定特異性s Ig A、Ig G及其亞類。免疫第42天,CCK-8法測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)(SI),ELISA法測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-17A、IL-4和IFN-γ含量。按一定比例將免疫血清、人補(bǔ)體、及生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的MC58菌液混合,檢測(cè)免疫血清體外殺菌活性。以致死劑量的MC58菌液攻擊實(shí)驗(yàn)小鼠,觀察記錄復(fù)合黏膜免疫佐劑輔佐的r NMB0315疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫保護(hù)效果。[結(jié)果]1.TEM觀察Chi-CpG NP和Chi-C48/80 NP呈球形,大小較均一,粒徑分布在150~200 nm之間;zeta電位值分別為11.25±0.052mv和19.54±0.069 mv,PDI分別為0.286和0.415;Chi-C48/80 NP對(duì)r NMB0315的吸附率為85.5%,強(qiáng)于Chi-CpG NP(71.2%)。2.Chi-CpG NP和Chi-C48/80 NP分別與r NMB0315聯(lián)用能誘導(dǎo)高水平的體液免疫應(yīng)答。r NMB0315+Chi-CpG NP組和r NMB0315+Chi-C48/80 NP組特異性Ig G、Ig G1、Ig G2a抗體效價(jià)峰值分別為1:150000、1:40000、1:50000;1:170000、1:60000和1:50000;鼻腔灌洗液和陰道分泌物特異性s Ig A抗體效價(jià)峰值分別為1:40000、1:40000;1:60000、1:40000;小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-4含量分別為176.48±19.79pg/m L、185.16±21.06pg/m L。上述與體液免疫相關(guān)的指標(biāo)均顯著高于r NMB0315單獨(dú)免疫組。免疫第42天,血清特異性Ig G2a/Ig G1比值趨向于1。3.r NMB0315+Chi-CpG NP組和r NMB0315+Chi-C48/80 NP組能誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)SI分別為1.569±0.153、1.799±0.188;IFN-γ的含量分別為126.09±11.77 pg/m L、182.48±16.25 pg/m L,均明顯高于r NMB0315組(P0.001);其中r NMB0315+Chi-CpG NP組誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)于r NMB0315+Chi-C48/80 NP組(P0.05,P0.01)。4.Chi-CpG NP和Chi-C48/80 NP輔佐的r NMB0315均能誘導(dǎo)Th17型免疫反應(yīng),促進(jìn)IL-17A的分泌。5.免疫第42天,r NMB0315組、r NMB0315+Chi-CpG NP組和r NMB0315+Chi-C48/80NP組小鼠免疫血清在補(bǔ)體介導(dǎo)下的體外殺菌抗體滴度分別為1:2、1:4和1:8;致死劑量B群腦膜炎奈瑟菌MC58攻擊后免疫小鼠的存活率分別為60%、75%和85%。[結(jié)論]1.成功制備了復(fù)合黏膜免疫佐劑Chi-CpG NP和Chi-C48/80 NP。2.Chi-CpG NP、Chi-C48/80 NP輔佐的r NMB0315疫苗經(jīng)鼻免疫小鼠能誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫,尤其是較高水平的黏膜免疫應(yīng)答。3.r NMB0315+Chi-C48/80 NP組免疫血清體外殺菌活性及對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫保護(hù)作用高于r NMB0315+Chi-CpG NP組。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的表達(dá)、純化及 Western blot 鑒定5 的表達(dá)、純化表達(dá) 6h, 表達(dá)的蛋白采用 Ni-NTA 親和層析GE 分析，得到與 rNMB0315 相對(duì)分子質(zhì)量。

4.2 Western-blot 鑒定重組蛋白 rNMB04.2 Analysis of rNMB0315 protein by WesteM: protein Marker； 1,2: the purified rNP 、Chi-C48/80 NP 特性檢測(cè) 、Chi-C48/80 NP 的形態(tài)Chi-C48/80 NP 經(jīng) TEM 觀察，如圖 4大小較均一，分散均勻，未出現(xiàn)明 、Chi-C48/80 NP 黏膜免疫佐劑是穩(wěn)

4 Chi-CpG NP 、Chi-C48/80 NP 對(duì) rNMB0315 的吸附率ading efficiency of Chi-CpG NP and Chi-C48/80 NP to rN NP 、Chi-C48/80 NP 輔佐的 rNMB0315 疫系統(tǒng)免疫應(yīng)答水平后血清特異性 IgG 水平檢測(cè)抗體應(yīng)答水平，發(fā)現(xiàn)血清 IgG 水平隨著免疫次高 ， 免 疫 后 14 天 rNMB0315+Chi-CpG NP 組 組（P＜0.05），rNMB0315+ Chi-C48/80 NP 組/80 組（P＜0.05），表明復(fù)合佐劑能夠迅速激發(fā)機(jī)315+Chi-CpG NP、rNMB0315+ Chi-C48/80 NP 組 I

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Rui-Qing Wu;Dun-Fang Zhang;Eric Tu;Qian-Ming Chen;WanJun Chen;;The mucosal immune system in the oral cavity——an orchestra of T cell diversity[J];International Journal of Oral Science;2014年03期

本文編號(hào)：2824051