第一部分MiR-142-5p高表達(dá)或抑制轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立 目的： 建立miR-142-5p在骨組織內(nèi)特異性高表達(dá)及抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,以進(jìn)一步分析miR-142-5p在小鼠體內(nèi)對(duì)骨折愈合的影響。 方法： (1)、首先合成pre-miR-142和miR-142-5p sponge序列,序列兩端包含SalⅠ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn),插入到本實(shí)驗(yàn)室保存的含骨鈣素啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒(pOG2-Cre-hGH)中,替換原質(zhì)粒的Cre序列。構(gòu)建好的質(zhì)粒分別命名為Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S,經(jīng)測(cè)序及酶切后電泳驗(yàn)證；(2)在MC3T3-E1前成骨細(xì)胞株中分別轉(zhuǎn)染Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S質(zhì)粒,使用含抗壞血酸及β-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)液誘導(dǎo)成骨分化72h,使用PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-142-5p表達(dá)水平變化；(3)將Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)顯微注射的方法注射到C57BL/6小鼠的受精卵原核內(nèi),待小鼠出生后3周使用PCR法鑒定表達(dá)質(zhì)粒已整合到小鼠基因組中；(4)使用PCR法檢測(cè)miR-142-5p和miR-142-5p sponge轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織內(nèi)的miR-142-5p表達(dá),驗(yàn)證兩種小鼠是否存在骨組織特異性的miR-142-5p表達(dá)增加或降低。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建了含骨鈣素啟動(dòng)子的pre-miR-142-5p和miR-142-5p sponge表達(dá)質(zhì)粒,其能在MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá),并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)miR-142-5p增加或降低； 2、成功構(gòu)建了骨組織特異性表達(dá)的pre-miR-142-5p和miR-142-5p sponge轉(zhuǎn)基因小鼠,可導(dǎo)致骨組織特異性miR-142-5p表達(dá)增加或降低。 結(jié)論： 成功構(gòu)建了骨組織特異性miR-142-5p高表達(dá)或抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,為下一步體內(nèi)研究miR-142-5p在骨折愈合過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。 第二部分MiR-142-5p高表達(dá)或抑制轉(zhuǎn)基因小鼠模型的骨折表型分析 目的： 研究體內(nèi)骨組織特異性miR-142-5p高表達(dá)或抑制對(duì)骨折愈合的影響,探討miR-142-5p在骨折愈合中的作用機(jī)制。 方法： (1)、使用單側(cè)開(kāi)放性股骨干橫形骨切開(kāi)術(shù)并鎖釘內(nèi)固定法,在野生型、rniR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)型以及miR-142-5p骨組織特異性抑制型轉(zhuǎn)基因小鼠中構(gòu)建骨折模型；(2)、使用X線(xiàn)攝片、組織切片HE染色檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后7d、14d、21d的骨折愈合情況,觀察miR-142-5p高表達(dá)或抑制對(duì)骨折愈合的影響；(3)、使用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后0d、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨鈣素表達(dá)水平,觀察其表達(dá)模式；(4)、使用qRT-P(CR及Western Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠骨折部位WWP1的表達(dá),在體內(nèi)驗(yàn)證WWP1為miR-142-5p的靶基因。 結(jié)果： 1、成功在野生型、miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)型及抑制型轉(zhuǎn)基因小鼠中構(gòu)建骨折模型。 2、X線(xiàn)攝片顯示,在miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)小鼠,骨折愈合速度較WT型明顯加快,而在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠,骨折愈合速度較WT則明顯下降。 3、組織HE染色顯示,在miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)小鼠,骨痂的鈣化、編織骨的形成及塑形完成較WT明顯增快,而在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠,骨痂的鈣化、編織骨的形成較WT則明顯下降。 4、在WT小鼠,miR-142-5p及骨鈣素水平在骨折后21天達(dá)到高峰；而在miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)小鼠,miR-142-5p及骨鈣素水平表達(dá)增加且在骨折后14天即達(dá)到高峰；在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠,miR-142-5p及骨鈣素水平較野生型顯著下降。 5、在小鼠中,骨折部位WWP1mRNA的表達(dá)水平隨著骨折后時(shí)間延長(zhǎng)均呈顯著上升趨勢(shì),并在骨折后21天達(dá)到高峰,在miR-142-5p抑制型轉(zhuǎn)基因小鼠上升較WT小鼠更顯著。結(jié)論： miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)可以促進(jìn)骨折愈合,而miR-142-5p骨組織特異性抑制則延緩骨折愈合,miR-142-5p在動(dòng)物模型骨折愈合過(guò)程中仍然通過(guò)靶基因WWP1發(fā)揮作用。 第三部分MiR-142-5p對(duì)衰老小鼠骨折愈合的治療作用 目的： 建立衰老小鼠骨折模型,觀察agomir-142-5p對(duì)衰老小鼠骨折愈合的治療作用。 方法： (1)、在18月齡的C57BL/6小鼠中行單側(cè)股骨骨干橫形骨切開(kāi)術(shù)并鎖釘內(nèi)固定,構(gòu)建衰老小鼠骨折模型；(2)、使用qRT-PCR法檢測(cè)衰老小鼠骨折后Od、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨鈣素表達(dá),觀察其表達(dá)模式；(3)、在骨折部位注射miR-142-5p擬似物agomir-142-5p,觀察衰老小鼠骨折后28d的X線(xiàn)表現(xiàn)；(4)、用組織HE染色法,觀察agomir-142-5p干預(yù)后衰老小鼠骨折后28d的骨折愈合情況。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建衰老小鼠骨折模型,并發(fā)現(xiàn)與年輕小鼠相比,衰老小鼠骨折后各個(gè)時(shí)期骨折部位miR-142-5p的表達(dá)均顯著降低。此外,衰老小鼠骨折后miR-142-5p的表達(dá)高峰延遲到骨折后28d。 2、在衰老小鼠,骨折后各個(gè)時(shí)期骨折部位骨鈣素的表達(dá)水平較年輕小鼠均顯著降低。 3、骨折后28天,注射PBS或Agomir對(duì)照的衰老小鼠X線(xiàn)攝片仍可見(jiàn)模糊骨折線(xiàn),骨痂量少,而在Agomir-142-5p注射的衰老小鼠,可見(jiàn)骨折線(xiàn)消失,骨痂較大,密度高。 4、在agomir-142-5p注射小鼠,28天時(shí)可見(jiàn)骨痂鈣化,部分連接成片,編織骨形成。而在agomir control及PBS注射小鼠,骨折后28天僅可見(jiàn)較多纖維性骨痂及軟骨性骨痂,部分鈣化。結(jié)論： Agomir-142-5p骨折部位局部注射能夠促進(jìn)骨折愈合,改善衰老小鼠骨折愈合延遲。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類(lèi)】：R683;R-332
【部分圖文】：

WT,miR-142-ob-TG和mR142-ob-S轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后7d.14d.lid的骨折部位組織切片的HE染色

圖2-5 qRT-PCR法測(cè)定WT和miR-142-ob-S轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后Od、7d、14d、2Id的骨折部位骨媽素表達(dá)水平。（*p<0.05)4、MiR-142-5p抑制轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后不同時(shí)期的WWP1的表達(dá)我們?cè)谇捌谘芯恐幸呀?jīng)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)WWP1為miR-142-5p在成骨細(xì)胞內(nèi)的祀基因。在WT與miR-142-ob-S轉(zhuǎn)基因小鼠骨折模型中，我們?cè)诠钦酆蟮?d、14天、21天分別行骨折部位qRT-PCR和Western檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在miR-142-ob-S轉(zhuǎn)基因小鼠中，WWP1 mRNA的表達(dá)水平隨著骨折后時(shí)間延長(zhǎng)均34

士學(xué)位論文 第結(jié)果、衰老小鼠骨折后不同時(shí)期骨痂部位iniR-142-5p表達(dá)我們?cè)?8月齡的C57BL/L小鼠中行單側(cè)股骨骨干橫形骨切^u術(shù)并鎖，構(gòu)建衰老小鼠骨折模型。在骨折后的Od、7d、14d、21d和28天，取組織通過(guò)qRT-PCR法行miR-:i42-5p表達(dá)檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)與年輕小鼠相小鼠骨折后各個(gè)時(shí)期骨折部位miR-142-5p的表達(dá)均顯著降低。此外，在骨折后21天，骨折部位rniR-142-5p表達(dá)水平達(dá)到高峰，而衰老小鼠骨折后28(1。（圖3-2)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 溫建民;徐穎鵬;董建文;潘貴超;孫永生;桑志成;胡海威;成永忠;;中醫(yī)骨折3期治療對(duì)家兔骨折各種骨痂組織VEGF及VEGF mRNA表達(dá)的影響[J];中國(guó)中藥雜志;2007年24期

本文編號(hào)：2817010